날고 뛰는 병원미생물, 세계를 덮친 감염 Phobia

출처 :http://news.hankyung.com/article/2017082452141

 

 세계 의료 시장의 패러다임은‘치료의학’에서‘예방의학’으로 바뀌고 있다. 예방의학 시대에 주목받고 있는 산업, 체외진단은 질병의 원인이 되는 바이오마커를 검출해 질병의 감염 여부를 파악하는 방법으로 신체 조직을 일부 떼어내 진단하는 조직검사법에 비해 조기 진단이 가능하여 예방의학 시대에 걸맞은 진단법으로 주목받고 있다. 유전자 정보를 담고 있는 핵산을 검사함과 동시에 진단의 정확도가 높고 기술의 발전으로 정량 분석까지 가능해져 기존 진단법을 빠르게 대체하고 있거니와 혈액이나 소변, 침 등을 사용해 조직검사 시 수반되는 피험자의 고통 및 거부감을 줄일 수 있다는 장점을 갖고 있다.

 21세기 들어 '신·변종 바이러스 감염병'에 대한 관심이 높아지고 있다. 사람과 물자가 실시간으로 이동하는 글로벌 사회에서 감염병은 국경을 초월한 초미의 관심사다. 어느 한 나라의 특정 질병이 아닌 한 번 창궐하면 그 파급력이 상상을 초월하게 된다.  이렇게 체외진단으로 진단되고 있는 감염증(Infectious disease)들은 박테리아, 바이러스, 기생충 혹은 곰팡이와 같은 병원성 미생물에 의해 질병이 야기된다. 직접적으로 혹은 간접적으로 한 사람에서 다른 사람으로 전염될 수 있고, Zoonotic diseases(동물매개 감염질병)와 같이 동물에게 발생된 감염병이 사람에게 전이될 수도 있다.  병원체가 생물체에 침입한 후 정착, 증식하여 감염을 일으킴으로써 조직을 파괴하거나 독소를 내어 몸에 해를 입히며 발생하는데, 반드시 일정한 잠복기를 거쳐야만 발병한다는 특징이 있다. 주된 감염경로로는 직접접촉, 환자의 침, 가래의 비말을 흡입하여 감염하는 직접감염, 병원미생물로 오염된 식품, 공기, 토양, 절지동물을 매개로 감염하는 간접감염을 들 수 있다.
 최근 핫한 이슈를 일으켰던, 누구나 이름을 들어봤을 만한 감염병 몇 가지를 소개해보려 한다. 전 세계적인 감염병 환자의 수를 파악하기는 어렵지만 감염병의 대부분은 현대 의료 기술의 혜택을 누리지 못하는 개발도상국에서 많이 발생한다. 해마다 감염병으로 인한 사망자가 500만명에 이르며 이 중 절반은 결핵, 말라리아, 후천성면역결핍증(AIDS)으로 인해 사망한다.

출처 : http://news.chosun.com/site/data/html_dir/2016/12/13/2016121300157.html

 

1. Cholera (콜레라)
 콜레라는 콜레라균(Vibrio cholerae)의 감염으로 급성 설사가 유발되어 탈수가 빠르게 진행돼 심할 경우 사망에 이를 수도 있는 전염성 감염 질환이다. 콜레라균은 분변, 구토물로 오염된 음식이나 물을 통해 감염되며, 오염된 손으로 음식을 조리하거나 식사할 때, 날 것이나 해산물에서 감염될 수 있다. 설사 및 탈수 증상을 일으키는 데에는 1억~100억 개 정도의 많은 수의 균이 필요하지만, 위절제술을 받은 사람은 더 적은 수의 균으로도 감염될 수 있다. 해외 여행객 및 외국인 노동근로자의 증가로 콜레라균의 국내 유입이 증가하고 있는 추세이다.  분변 배양 검사를 통하여 콜레라균의 특정적인 움직임과 균의 검출유무를 진단하며, 균에 대한 항독소나 항체 수의 상승 등의 면역반응 혈액 검사로도 이상 증상을 확인할 수 있다. 수액 주입으로 손실된 수분과 전해질을 공급하고 체내 전해질 불균형을 교정하는 것이 주된 치료 방법이다.

 

2. Tuberculosis(결핵)
 결핵은 인류 역사상 가장 많은 생명을 앗아간 감염 질환으로 연 평균 약 2백만명이 사망한다고 알려져 있다. 결핵은 결핵균에 의한 감염 때문에 발생하며, 가슴통증이나 기침, 피가 섞인 가래 증상으로 결핵 검사 실시 시, TB 박테리아가 폐에서 관찰된다. 그 외에도 체중 감소, 식욕 부진, 열, 피로, 냉기 등의 증상이 있다. 

출처 : medcomic.com by Jorge Muniz(http://www.healthtipsever.com/what-is-tuberculosis/에서 재인용)

 생리학적으로 결핵균에 의한 감염이 발생되면 숙주들은 세포매개성 면역과 지연과민반응인 면역반응을 일으키고, 그 중 T림프구가 가장 중요한 역할을 한다. 결핵은 폐결핵 뿐만 아니라 흉막, 림프절, 척추, 뇌, 신장, 위장관 등 여러 부위에서 발병하며 그 증상도 다르다.  현재 결핵균의 감염 여부를 진단하기 위해 사용되는 방법 몇 가지를 소개하고자 한다. 투베르쿨린 피부반응 검사(Tuberculin Skin Test)를 시행할 수도 있고, 활동성 여부를 확인하기 위해 흉부 X선 촬영, 균 유무를 판단하기 위한 도말검사 및 배양검사가 시행된다. 혈액 검사에서는 일반적인 급성 염증 반응; 적혈구 침강속도(ESR)의 증가, 백혈구의 수 증가, C 반응성 단백질(CRP)의 증가를 통해 결핵을 진단하는데 부족한 경우 환자에 따라 흉부 전산화 단층촬영(CT), 기관지 내시경 검사 등을 시행하기도 한다.  최근에는 빠르고 정확한 중합효소 연쇄반응법(PCR)을 통한 결핵균 검사, 폐결핵 감염 여부를 보다 정확히 알 수 있는 체외 인터페론감마(Interferon-gamma) 검사 등이 도입되었으며, 일단 결핵이 진단되고 나면 배양된 결핵균에 어떤 약이 효과가 있는지를 알아보기 위한 약제 감수성 검사, 검출된 균의 결핵균 여부를 확인하는 균 감별검사 등을 시행하기도 한다.

 

3. Malaria(말라리아)
 말라리아 원충에 감염되어 발생하는 급성 열성 전염병으로 말라리아를 일으키는 말라리아 원충은 얼룩날개 모기류에 속하는 암컷 모기에 의해서 전파되는데, 우리나라에서는 중국 얼룩날개 모기암컷이 말라리아 원충을 전파시킨다. 말라리아 원충에 감염된 모기에게 물린 후 인체에서 감염 증상이 나타날 때까지는 2주~수개월의 시간이 소요된다. 오한, 발열, 발한의 전형적인 감염 증상이 나타나는데 원인 병원체의 종류에 따라 증상 및 특징이 다르다.

출처 : 서울대학교병원 의학정보(네이버 지식백과에서 재인용)

 말라리아 진단들 중 대표적인 4가지를 소개하자면, 첫 번째 혈액 도말 검사는 많은 양의 혈액을 도말하여 건조시킨 후 적혈구를 모두 파괴시키고 원충과 백혈구만 현미경으로 검사하므로 말라리아 양성 또는 음성의 판정에 매우 편리한 방법이다. 그러나 종을 감별하는 것은 어려운 경우가 많다. 두 번째는 아크리딘 오렌지 염색으로 환자 혈액 5㎕와 아크리딘 오렌지 용액 10㎕를 슬라이드글라스에서 혼합한 후 커버글라스를 덮어 2∼3분간 잠시 두었다가 형광현미경으로 검사하는 방법이다. 그 외에도 혈청학적 검사 ELISA(enzyme-linked Immunosorbent assay, 효소면역측정법)를 통해 단백질 항원을 이용하여 대량의 시료를 검사할 수 있고, PCR로 말라리아 원충의 유전자를 primer로 확인하는 유전자적 검사법이 있다.

 

 

4. AIDS
 후천면역결핍증후군 AIDS는 인간 면역결핍 바이러스(HIV, human immunodeficiency virus)에 감염되어 면역세포인 CD4 양성 T림프구가 파괴되면서 인체의 면역 저하로, 각종 감염성 질환과 종양이 발생하여 사망에 이르는 질병이다.  HIV 바이러스는 HIV-1과 HIV-2로 나뉘는데, 전 세계적으로 확산되어 HIV 감염을 일으키고 있는 것은 HIV-1이다. HIV-2는 주로 아프리카 일부 지역에 분포되어 있다. HIV-1은 유전적인 특성에 따라 다양한 아형(subtype)으로 나뉘는데 이러한 아형들은 지속적인 유전적 변형을 통하여 그 다양성이 증가하고 있다. HIV의 감염경로는 감염인의 체액에서 다른 사람의 체내로 들어가면서 전파가 되며, 감염인과의 성행위, 정맥용 주삿바늘을 함께 사용했을 경우, 수직감염(산모로부터 태아로 감염이 전파되는 것)과 같은 3가지의 경로로 흔히 감염된다.
 HIV 감염의 증상은 감염 초기의 급성 HIV 증후군, 이 후에 이어지는 무증상 잠복기, 면역력이 현저하게 떨어져 기회감염을 비롯한 다양한 병적인 증상이 나타나는 후천성 면역결핍증 시기의 세 단계로 나눌 수 있다.  급성 HIV 증후군은 바이러스에 감염된 후 3~6주 후에 발생하며 발열, 인후통, 임파선 비대, 두통, 구역, 구토, 피부의 구진성 발진 등의 증상이 나타나고, 심한 경우 뇌수막염이나 뇌염도 동반될 수 있다. HIV에 처음 감염된 후 조기에 감염이 진단되지 않으면 환자 본인도 감염 사실을 알지 못한 채 다른 사람에게 HIV를 전파시킬 수 있기 때문에 초기에 환자를 찾아내어 치료하는 것이 중요하다. 급성 HIV 증후군 시기가 지나면 무증상 잠복기가 10년 정도 지속되는데 이 시기에는 HIV 감염을 의심할 수 있는 특이한 증상이 나타나지 않는다. 비록 겉으로 드러나는 증상은 없지만 무증상 잠복기 동안 HIV 바이러스는 지속적으로 면역세포를 파괴하므로 인체의 면역력이 점차적으로 저하된다. 면역력이 어느 정도 이하로 떨어지면 건강한 사람에게는 거의 발생하지 않는 여러 종류의 감염성 질환이 발생하고, 보통 사람에게 약하게 나타나는 감염성 질환도 후천성 면역 결핍증 환자에게는 심각한 질병으로 나타난다. 또한 면역 결핍으로 인해 악성종양이 현저하게 많이 발생하므로 사망에 이르게 된다.  혈액에서 HIV에 대한 항체나 HIV의 항원을 직접 찾아내는 혈액검사를 통해 감염을 진단 할 수 있다. 항체 생성이 지연되는 경우가 있어 최대 6개월까지 혈액 선별 검사에서 양/음성 결과를 파악하며, 최근, HIV 바이러스를 강력하게 억제할 수 있는 치료제가 개발 되었으나 아직까지 HIV의 완치는 불가능하다. 지속적인 항 HIV 약제 투입은 부작용이 따르므로 감염 초기에는 사용하지 않는다. 그러다 바이러스 수와 면역세포 수가 일정 기준을 넘으면 항 HIV 치료제 칵테일요법으로 치료한다.

출처:월드비전(https://my.worldvision.or.kr/mySponsor/lastestNewsView.asp?page=1&search_product=&search_sponsor=2&gubun=B&board_seq=70)


5. MERS(메르스)
 중동 지역에서 집중적으로 발생하는 코로나바이러스(Coronavirus)의 감염으로 발발한 중증 급성 호흡기 질환인 메르스는 사스와 유사한 고열, 기침, 호흡곤란, 심한 호흡기 증상이 나타난다. 근래에는 중동지역의 아라비아 반도를 중심으로 감염환자가 주로 발생하여 ‘중동 호흡기 증후군’으로 명명되고 있다. 아직 명확한 감염원과 감염경로는 확인되지 않았으나, 중동 지역의 낙타와의 접촉을 통해 혹은 사람간의 밀접접촉에 의한 전파가 가능하다고 보고되고 있다.

출처 : 세계보건기구(http://www.who.int/emergencies/mers-cov/en/)

 

6. SARS(사스)
 MERS 이전 세계적인 공포를 불러일으켰던 감염병은 SARS이다. 2002년 겨울, 홍콩 거리의 사람들이 모두 마스크를 쓰고 다니는 영상이 연일 뉴스를 통해 흘러나왔고 이 새로운 질병의 치료제나 백신이 개발되지 않아 국민들의 불안감이 고조되었다. 6개월 만에 30여개 나라에 퍼질 정도로 전파 속도가 빠르고 광범위 했으며, 25세 이하의 젊은 사람들에게는 치사율이 1%이하이지만, 65세 이상 노인들에서는 50% 치사율이 나타날 정도로 무서운 감염병이였다. 사스(SARS)는 ‘중증급성호흡기증후군’의 줄임말로 증상은 발열, 기침, 호흡곤란, 심하면 폐렴으로까지 발전해 죽음에 이를 수 있다.  사스는 사스-코로나 바이러스로 발병되며, 코로나 바이러스를 전자현미경으로 보면 태양의 코로나와 형상이 비슷하여 명명되어졌다. 코로나 바이러스는 닭에서 처음 발견되었고, 소나 돼지 같은 일부 동물에게 매우 치명적인 바이러스이다. 사스-코로나 바이러스는 감기와 같이 가벼운 코감기나 설사를 일으키는 정도이지만 바이러스가 변이되면 인간에게 치명적인 바이러스가 된다.

 

 

7. Influenza (인플루엔자)
 유행성감기 혹은 독감이라고 불리는 인플루엔자는 오소믹소바이러스과의 인플루엔자 바이러스가 폐 및 기도를 감염시켜 유발하는 감염성 질환을 말한다. 일반적인 증상은 오한, 발열, 콧물, 인후통, 인후염, 근육통, 두통, 기침, 무력감과 불쾌감, 병감이다. 독감은 이런 비특이적 증상의 정도가 몸살감기보다 심한 정도일 뿐, 치명적인 경우는 드물다. 그렇지만, 전격성 폐렴이나 라이증후군 같은 치명적인 합병증을 일으키기도 하는 등 감기와는 명백히 다르며, 기도 내 더 깊은 세포들까지 영향을 끼친다. 보통 감염자의 기침이나 재채기를 통해 공기 중으로 나오는 바이러스를 흡입함으로써 인플루엔자에 감염된다. 조류의 배설물, 침, 콧물, 대변과 혈액으로도 전염될 수 있다.

출처 :http://www.codigosanluis.com/secretaria-de-salud-informa-corte-de-vacuna-de-influenza/

 인플루엔자에는 세 가지 바이러스 유형이 있다. A형과 B형 인플루엔자 바이러스 내에는 다양한 계통이 있고, 모두 유사한 질병을 일으키며 C형은 일반적인 인플루엔자 질환을 일으키지 않는다. A형이 인플루엔자 사례의 95%를 유발하며, 나머지의 대부분은 B형이 원인이다. C형 인플루엔자는 발생 빈도가 떨어지며, 주로 소아에서 발생하게 되는데, 바이러스 표면에 존재하는 단백질 등의 변이가 돌연변이로 조금씩 다른 형태를 띄면서 더 이상의 이전 백신으로는 효과를 볼 수 가 없게 된다. 매년 인플루엔자 예방접종을 받는 것이 인플루엔자 감염 예방을 위한 최선의 방법이다.

 

8. Ebola Hemorrhagic Fever 

출처 : http://www.ezhealthmd.com/medical-condition/ebola/what-does-ebola-do-to-the-body/

 서아프리카에서 시작된 에볼라 바이러스는 치사율이 최고 90%에 이를 정도로 ‘공포의 바이러스’로 불린다. 에볼라 바이러스가 처음 발견된 건 1976년이다. 필로바이러스과에 속하는 에볼라 바이러스는 콩고공화국의 강 이름을 따서 ‘에볼라’라 불리게 됐다. 필로바이러스류는 대부분 치명적인 출혈열을 불러오며, 에볼라성 출혈열이 가장 위험한데, 에볼라는 독감 비슷한 열 증상과 함께 내출혈 증상이 나타난다. 사망 직전의 에볼라 환자들에게서만 출혈열이 나타나며, 초기에는 고열만 그 이후 설사와 구토, 복통이 나타나고 대부분의 환자들은 출혈보다는 저혈압으로 인한 쇼크나 다발성 장기 부전으로 사망한다. 에볼라 바이러스는 보통 2일에서 21일의 잠복기를 거치며 발열, 오한, 두통, 식욕부진, 근육통 등 감기와 증상이 비슷하나 인체에 치명적이다. 감염된 사람의 체액, 분비물, 혈액 등을 직접 접촉하거나 감염된 침팬지, 고릴라 등 동물과 접촉했을 때 감염될 수 있다. 정확히 어떻게 인체에 영향을 주는지는 완전히 밝혀지지 않았지만 체내에 있는 콜라겐 조직에 침투하여 증식하고 조직을 파괴한다고 알려져 있다. 이 콜라겐은 세포들을 묶어주거나 연결해주는 역할을 하는 세포외 기질 단백질의 한 종류로, 이 콜라겐이 완전히 파괴되면서 세포간의 연결이 죄다 끊어져 조직이 분해되어 버린다는 설이 있고 그로 인해 주요 조직들이 녹아내리며 끔찍한 통증 수반과 다발성 장기 부전으로 사망하게 되는 것이다.

 

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PCR, 넌 어디까지 알고 있니?

 

PCR(polymer chain reaction)은 원하는 DNA의 sequence를 통해 다량의 DNA를 증폭하는 기술이다. Denaturation, Annealing, Extension의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 DNA template, primer, dNTP, polymerase등으로 구성되어 진행된다. 오늘은 유전자를 증폭시키는 PCR의 여러 가지 종류를 파헤쳐 보고자 한다.

 

1) RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.thermofisher.com

특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 뒤, PCR 증폭을 시행하는 기술이다. 실험 과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, 2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 노던 블롯 혼성화 분석(Northern blot hybridization)과 같은 방법을 사용하는 RNA 분석보다 실험방법이 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 복제(cloning) 할 수도 있다.

 

2) Allele-specific PCR
 DNA상에서 하나의 염기만 다른 SNP(single-nucleotide polymorphisms, 단일염기변이)를 분석하는 기술로서 서로 다른 allele의 DNA sequence만 안다면 primer를 제작하여 allele-specific PCR을 진행할 수 있다. Allele-specific PCR은 template과 SNP-specific primer사이에 불일치(mismatch)의 존재를 정확하게 판단하여 기존의 PCR에서의 비특이적인 증폭(amplification)을 막아 성공적으로 원하는 template만을 증폭 시킬 수 있다.

출처 : https://www.slideshare.net/

 

 

3) Asymmetric PCR
 Asymmetric PCR은 비대칭의, 불균형의 의미를 갖는 Asymmetric이란 단어에서 알 수 있듯이, 이중가닥의 DNA 중 한 가닥의 DNA만을 증폭시키는데 사용하는 기술이다. Single strand만을 얻을 목적으로 사용되며, Primer를 두 개 사용한다. 두 primer의 농도를 100:1로 섞어 PCR을 진행하는데, PCR 초기단계에서 한쪽의 primer는 소비되어 버리고 과잉의 primer에서 single strand DNA가 생성이 된다.

출처 : https://www.researchgate.net/

 

4) RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 

출처 : https://www.slideshare.net/

cDNA를 복제(cloning)하기 위해서는 cDNA library를 검사(screening)하는 방법이 가장 일반적이지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전체 cDNA를 얻어낼 수 있다. 반복 작업이 필요한 만큼 상당한 시간과 노력이 소모되는 작업이고, 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우엔 더욱 힘든 작업이 되어 버린다. 이 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 RACE(rapid amplification of cDNA ends) PCR 기술을 만들어 냈다. cDNA의 일부 염기서열만 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR 반응(reaction)을 통해 5'-end 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE PCR 방법에서는 모든 mRNA 3'-end에 존재하는 poly(A) tail(AAAAAAAA...AAAA-3')을 이용하여, 그와 상보된 oligo-(dT) primer(5'-TTTTTT...TTT-3')를 반응시켜 cDNA를 합성 시킬 수 있다.

 

5) IS-PCR(In Situ Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.slideshare.net/

 PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 민감성(sensitivity)과 ISH의 특정성(specificity)을 고루 갖추고 있다. IS-PCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, 슬라이드 글라스(slide glass) 등의 사용에 적합한 IS-PCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.  IS-PCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl(염화수소, 강산), proteinase K(단백질분해효소) 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 적절한 선택과 사용이 중요하다. 아직까지는 IS-PCR 방법의 효율이 기대효과 대비 그다지 높지 못하지만, 민감성과 특정성이 높아야 되는 진단 및 분석 분야에서는 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 

 

6) Hot start PCR
 Taq1 polymerase 효소는 37℃에서도 효소 활성이 좋기 때문에 간혹 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가 DNA 분자에 붙어 증폭(extension)되는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 결합(annealing)이 일어날 경우 primer의 불일치 접합 확률이 높고, 결과적으로 정확도가 떨어지는 결과를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot-start PCR기술이다. Hot-start PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에야 PCR이 진행되게 필요한 물질(ex. polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. 그러면 primer가 불일치하는 DNA 분자와 붙는 상황을 피할 수 있어 상대적으로 명확한 결과를 얻을 수 있다.

출처 :https://us.bioneer.com/

 

7) RAPD PCR 

출처 : https://www.researchgate.net/

 RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다. PCR을 진행할 때 primer가 짧을 경우 게놈(genome)상의 이곳저곳에 달라붙어 여러 조각(fragment)을 생성하게 되고, 전기영동을 사용하면 생명체마다 각각의 독특한 band를 형성하게 되는데, 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이며, 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이가 나타날 것이다. 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬워 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 확인하기 위해 사용된다.

 

8) Real time qPCR(quantitative PCR)
 PCR 산물의 양을 실시간으로 측정하기 위해 사용되는 기술이다. DNA, RNA, cDNA의 양을 정량적으로 분석할 수 있고, 한 샘플에서 PCR 산물의 copy 수를 측정할 수 있다. RT-qPCR 방법에서는 형광염색법(dye)을 사용하는데, SYBR-green, Evagreen 혹은 DNA probe를 가진 형광, Taqman을 이용해 실시간으로 증폭되는 산물의 양을 정량적으로 측정한다.

 

9) Nest PCR 
 Nest PCR은 한 번 PCR로 증폭한 DNA 단편을 한 번 더 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 방법이다. 두 개의 서로 다른 primer set를 이용하여 연속적으로 두 번의 PCR을 진행하게 되면 비특이적 반응을 감소시킬 수 있어 정확하고, PCR을 2회 실시하므로 감도가 상승하는 효과를 얻을 수 있다.

출처 : https://en.wikipedia.org/wiki/Nested_polymerase_chain_reaction

10) Multiplex PCR

출처 : https://www.labce.com/pcr_fundamentals.aspx

한 번의 PCR로 서로 다른 여러 개의 DNA들을 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. 반응시킬 용액에 서로 다른 DNA를 증폭시킬 primer를 첨가해 target sequence에 붙을 수 있도록 PCR 조건을 잡아주면 한 번에 증폭되어 상당한 시간과 노력을 절약할 수 있다. 그러나 한 번에 여러 가지 target을 증폭시키기 때문에 각 primer set들의 annealing 온도를 비슷한 범위에서 최적화 시켜야 되는 전처리 작업이 필요하다. Multiplex PCR은 병원균 확인, SNP genotyping, 돌연변이 분석, template의 양, RNA를 detection 하는데 유용하다.

 

11) Inverse PCR 
 Inverse PCR은 이미 서열을 알고 있는 DNA의 양 옆에 서열을 알지 못하는 부분을 알고자 할 때 많이 이용된다. 예를 들어 5’-xxxxxxx=========xxxxxx-3’ (x서열을 모름, =서열을 알고 있음)
이런 염기 서열에서 x 부분을 알고자 할 때 사용되는데, 제일 먼저 제한 효소로 자르고, 자른 부위를 원으로 만든다. 그리고 그 원으로 된 곳에primer를 붙이는데, 이 때 연장(elongation)과 같은 방향으로 가도록 primer를 붙인다. Inverse라는 말은 primer가 기존의 PCR과는 다른 방향으로 간다고 해서 붙여졌다.

출처 : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/da/Inverse_PCR_2.png

이 외에도 더 많은 PCR 종류들이 산업, 의학, 과학, 농업 등 다양한 분야에서 사용되어지고 있으며, 더 효율적인 PCR 기술들이 현재도 개발되고 있다. PCR은 분자생물학의 표준 실험법으로 특정한 유전자를 증폭하여 유전형을 알아보는 것부터, 신종플루, HIV, 지카바이러스, 콜레라균 등 온갖 병원균을 검출하고 종류를 확인할 때, 변사체의 신원을 분석할 때, 네안데르탈인의 뼈에서 추출한 DNA로부터 현생인류와의 관련성을 찾아 볼 때 등 굉장히 다양한 분야에서 적용되고 있다. 전 세계 PCR 시장의 규모와 PCR 기반 기술로 작동하는 차세대 시퀀싱 시장들이 200억 달러 이상의 규모가 될 것이라는 예상처럼, PCR은 현대문명을 구성하는 하나의 핵심적인 기술인 것이다.

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NGS를 응용한 sequencing 방법

 

 NGS(Next-generation sequencing)의 비약적인 발전으로 레퍼런스 염기서열이 없이 분석이 가능한 de novo sequencing, 유전자 발현 변화를 볼 수 있는 transcriptome profiling, 코딩 영역만 해독하는 엑솜시퀀싱 및 질병의 진행 여부 연구까지 NGS가 있어 가능해졌다. 이번 기사에서는 NGS를 응용한 sequencing 방법들에 대해 이야기해보고자 한다.

(1) Resequencing
 Resequencing은 이미 레퍼런스 유전체가 완성된 생물종의 다양한 유전체를 분석하고 그 서열을 레퍼런스와 비교함으로써 특정 유전체 내 SNP 등의 변이를 발굴하고자 할 때 주로 쓰인다. NGS가 가장 널리 활용되고 있는 분야이며 엑솜 시퀀싱, 유전자를 이용한 진단 검사 의학, Genome-wide association studies(전장유전체연관분석연구, GWAS) 등으로 응용된다.
☞ 여기서 잠깐, SNP란?
단일염기 다형성 [single nucleotide polymorphism, SNP]으로 불리며, 염색체의 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기들 중의 하나에 나타나는 일반적인 돌연변이이다. 약 500 ~1,000염기 당 1개꼴로 나타나며 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다.

(2) Whole exome sequencing (WES)
 RNA 서열 상 단백질을 만들어내는 총 영역, 엑솜(Exome)은 전체 인간 유전체의 2% 정도 밖에 차지하지 않지만, 현재까지 알려진 질병 관련 유전자들의 85% 가량이 엑솜에 위치해 있다. 따라서 질병 관련 유전자 발굴 및 진단 검사에는 빠르고 효율적이면서 저비용의 분석이 가능한 엑솜 시퀀싱을 주로 활용한다. 전체 서열에서 엑솜만을 시퀀싱하기 위해서는 엑솜에만 해당하는 probe를 샘플에 섞어주는 solution-based capture나 probe를 칩에 붙여서 추출해내는 array-based capture법, PCR을 이용한 방법 등이 있다. 그러나 라이브러리 제작 단계에서 엑솜 내 G염기와 C염기의 함량의 차이 등으로 인하여 capture probe와 DNA 조각 간의 결합력의 차이가 발생하는 등 라이브러리의 편중화가 일어날 가능성이 많다는 한계점이 있다.

(3) 분자진단검사, 임상의학
 기존의 ‘생어 시퀀싱법’은 분석 시간 및 비용의 문제로 특정 질환에 특이적인 소수의 유전자 검사만이 수행되었고 정확도가 낮았다. 그러나 NGS의 발전으로 인하여 하나의 샘플에서 다양한 질병 관련 유전자들을 동시에 분석할 수 있게 되었다. 이러한 assay들이 다양하게 개발되고 진단 장비로 승인을 받게 되면서 맞춤 의학 (companion diagnostics)시장까지  큰 영향력을 펼치게 될 것으로 기대된다.
 NGS는 임상 의학에서도 다양하게 활용될 수 있다. 한 예로 장기 이식 환자의 혈액에서 장기 제공자의 유전체와 일치하는 cell-free DNA가 검출되는지의 여부를 NGS로 확인한 사례가 발표되었다. 이 뿐만 아니라 임산부의 혈액에서 태아의 cell-free DNA가 발견된 연구를 이용하여 태아의 비침투 산전 검사를 수행한 연구가 발표되었다. 질병을 일으키는 대장균 등 다양한 세균들과 자궁경부암을 일으키는 HPV 등 바이러스의 체내 존재 여부 및 종 식별을 NGS로 빠르게 분석할 수 있게 되었다.

(4) Mapping-by-sequencing 법을 이용한 Forward genetic screening
 전통적인 forward genetic screening은 표준 개체와 돌연변이를 지속적으로 교배하면서 유전자 마커를 기준으로 mapping해야 했으므로 오랜 시간이 소요되었다. 그러나 NGS 분석 비용이 감소한 현재는 NGS를 이용하여 돌연변이체의 유전체를 분석하고 표준 유전체와 직접 비교함으로써 분석 시간을 단축할 수 있게 되었다.

(5) GWAS (Genome-Wide Association Study)
 GWAS란 각 개체의 유전체를 해독하여 비교, 분석함으로써 특정 질병과 연관된 유전적 요인을 찾고자 하는 연구이다. 인간의 SNP는 1억 개 가량이 발견되었고, 이 정보를 바탕으로 특정 질환을 앓고 있는 환자와 정상인의 유전체를 해독함으로서 SNP의 차이를 분석해 환자 집단에서의 해당하는 유전자를 추려내어 질환과 연관된 유전자를 발굴해내는 것이 GWAS의 연구 방법이다.

(6) 미생물의 종 식별 및 메타지노믹스(metagenomics)
 동, 식물에 비해 미생물의 유전체는 상대적으로 크기가 작기 때문에 유전체 해독이 상당히 진행되었다. 현재 미생물학계에서는 단일 생물종의 유전체 해독 연구를 넘어서서, 특정 환경에서 수집한 샘플에 함유된 유전체를 분석함으로써 각 환경의 미생물 군집을 파악하고자 하는 meta-genomics 연구가 활발히 수행되고 있다.

(7) Single-cell genomics
 NGS 분석 기술이 발달함에 따라 미량의 DNA 시료로도 성공적으로 sequencing 분석이 가능해지면서 단일 세포의 유전체를 알고자하는 single-cell genomics 연구가 활기를 띄게 되었다. 세포 분열과정에서 DNA가 복제를 거듭하면서 돌연변이가 발생할 가능성이 항상 존재한다. 따라서 한 개체에 있는 세포라 하더라도 각각의 유전체에는 미묘한 변이가 발생한다. 또한 이러한 돌연변이는 질환의 원인으로 작용하기도 하는데 한 연구에 따르면 정상 조직과 질환을 앓고 있는 조직의 유전체를 비교했을 때 변이율이 이론상 계산 결과보다 상당히 높았다. Single cell genomics를 통해 각 단일 세포의 유전체 서열을 분석함으로써 발달 생물학이나 암 생물학 연구에 응용시킬 수 있다. Single-cell genomics 연구에서는 아직까지 단일 세포의 정확한 분리와 미량 유전체의 증폭이 정확하지 않다는 한계점을 갖고 있어 현재의 NGS 분석을 위해서는 유전체 증폭 등의 과정이 필수적이다.

(8) de novo assembly(신생조합)
 de novo assembly는 아직 전체 염기서열이 해독되지 않은 생명체의 염기서열을 NGS로 분석하여 genome 또는 transcriptome을 구축하는 작업을 말한다. NGS 기술의 발전과 이를 뒷받침하는 생물 정보학의 발달로 주요 모델 생물에 이어 다양한 생물자원의 유전체 해독이 가능하게 되었다. 이러한 연구는 수많은 동물들의 유전체 해독을 목표로 현재는 1만종 이상의 척추동물 유전체를 해독하자는 Genome 10K 프로젝트가 추진되고 있다. NGS를 이용한 de novo assembly가 본격적으로 시작되기 전 이미 BAC 클론을 이용한 생어 시퀀싱으로 해독되고 있던 유전체들도 이제까지 얻은 결과와 NGS를 이용한 분석 결과를 조합함으로써 유전체 해독에 가속도를 붙일 수 있었다. 하지만 아직까지 NGS만으로 해독된 유전체 정보는 생어 시퀀싱으로 제작된 유전체에 비해 전체적인 완성도가 낮다는 한계를 갖고 있어 NGS만을 이용하여 de novo assembly를 진행하고 있지는 않다.

(9) Transcriptome sequencing
 mRNA sequencing은 NGS 기술의 발달로 현재 대부분 RNA-Seq으로 대체되었다. 기존 Microarray 방법으로는 특정 mRNA의 증가 또는 감소량 정도만 파악할 수 있었지만, NGS는 mRNA의 염기 서열을 직접 해독하게 됨으로써 그 전까지 불가능했던 RNA editing이나 대립유전자의 특정적인 발현(allele-specific expression) 등의 관찰이 가능하게 되었다. 게다가 mRNA 뿐만 아니라 small RNA 등의 non-coding RNA의 분석도 가능하게 되었으며, 엑손/인트론 구별 및 서열 정보가 불충분한 생물의 trasncript들까지도 분석 가능한 수단으로 사용된다.
 ☞ 여기서 잠깐, RNA-Seq은 mRNA나 miRNA 등 원하는 RNA를 분리한 뒤, RNA를 DNA로 변환한 후 어답터를 붙여 라이브러리를 제작하는 것이다. RNA는 유전체와 달리 세포 내에 존재하는 양이 그 특징에 따라 매우 다양하기 때문에, 극소량의 mRNA까지 성공적으로 검출해내기 위해서는 최대한 많은 read를 읽음으로써 sequencing depth를 올리는 것이 무엇보다도 중요하다. 또한 transcriptome의 대다수를 차지하는 rRNA 등을 효과적으로 제거하는 것도 도움이 된다. 하지만 아직까지 miRNA 등 small RNA는 크기가 작기 때문에, 라이브러리 제작에 사용되는 아답터의 false positive 아답터-이합체(adapter-dimer) 와 구별하기 어렵다는 한계점이 있어 NGS를 이용한 transcriptome 분석법의 발전을 위해서는 고품질의 라이브러리 제작법에 대한 연구가 뒷받침되어야 할 것이다.

 산업계에서의 NGS 응용 가능성은 최근 다양한 측면으로 제시되고 있다.  특정 세포주를 세대를 반복하여 ‘계대 배양’(세포 증식을 위해 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법)하면 그 과정에서 유전체 또는 후성 유전학적 변이가 생기는 경우가 있는데, 각 세포주의 유전체를 NGS를 이용하여 빠르게 분석하며 각 단계에서의 돌연변이를 모니터링 함으로써 세포주의 품질을 유지할 수 있게 되었다. 또한 다양한 환경에서의 세포의 활성 변화 및 유전자 발현 패턴의 변화를 관찰하는 데에도 유용하게 사용되고 있어 각 유전자의 기능을 연구하던 연구자들은 이제 특정 생명 현상과 관련된 모든 유전자들 사이의 상관관계를 통합적으로 파악할 수 있게 되었다. NGS 분석에 소요되는 비용이 저렴해진 만큼, 향후 생어 시퀀싱 방법의 사용과 같이 빈번하게 사용될 것이다. 다만 한 번의 NGS 분석으로 상당히 많은 양의 데이터가 생성되기 때문에, 생성된 데이터를 어떻게 분석하여 그 중에서 유의미한 결과를 추출해낼 것인지에 대한 충분한 계획을 세워야 한다.  빠르게 변하는 기술 동향을 정확하게 파악하면서 NGS 기술을 아는 만큼 응용할 수 있었으면 한다.

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  1. 표절봇 2018.01.15 15:30 신고  댓글주소  수정/삭제  댓글쓰기

    BRIC View 동향리포트인
    '최근 차세대염기서열분석(NGS) 기술 발전과 향후 연구방향'을
    그대로 베껴서 작성하셨는데
    출처표기 하나 없이 이렇게 해도 되는 건가요?

다양한 암세포, 인공 표적 기술로 한 번에 잡는다

신개념 암세포 인공 표적화 기술개발로 기존 암 치료법의 한계 극복  
향후 암 표적치료제 개발 분야 연구에 활용 기대

 

종양 내 암세포의 이질성*은 항암치료 및 표적항암치료에 대한 저항성 및 재발 기전을 이해하고 성공적인 항암치료 및 표적항암치료 기술개발을 위한 매우 중요한 개념으로 주목받고 있다. 최근 국내 연구진이 이질성을 갖는 암세포를 효과적으로 찾아낼 수 있는 신(新)개념의 암세포 인공 표적 기술 개발에 성공했다. 이 기술은 암세포의 유전학적 다양성에 의해 나타나는 이질성 극복을 목적으로 특수한 나노입자를 암 조직에 전달하여 암세포가 인공 수용체를 발현하도록 하고 이를 인위적으로 표적할 수 있도록 하는 기술이다.
*이질성(heterogeniety) : 종양 내 서로 다른 특성을 지닌 암 세포들이 함께 존재하는 현상. 동일 종양 내 서로 다른 특성을 지닌 암 세포가 존재하는 경우 종양 내 이질성(Intra-heterogeniety), 같은 암 종의 환자 개개인간의 암 세포의 다른 특성을 개체간 이질성(Inter-heterogeniety)이라 함.

<그림 1> 암 세포 인공 표적 기술의 모식도:생체 내 이질성을 갖는 암 세포의 인공 표적을 위해 비천연 당전구체를 전달 할 수 있는 덴드리머-비천연 당전구체 접합체 제작 및 인공수용체 발현 모식도. 암 세포 표면에 발현된 인공수용체와 클릭화학을 이용해 약물전달체인 리포좀을 이질성을 갖는 암 조직에 성공적으로 전달하였다.

한국과학기술연구원(KIST, 원장 이병권) 테라그노시스연구단 김광명 박사팀은 거대한 분자 화합물(덴드리머) 기반으로 특수한 전달체(비천연 당전구체)를 제작하여 당대사공학 및 생물직교성 무동 클릭화학**을 이용한 이질성을 갖는 암 세포를 표적하는 신개념의 암 세포 인공 표적 기술 개발에 성공했다. 연구진은 화학적 표지가 가능한 수용체를 세포 표면에 도입하여 특이적으로 연결하는 결합 반응을 통해 이질성을 갖는 암 세포의 인공 표적을 가능하도록 했다. 이에 암세포의 이질성에 의한 항암치료 저항성을 극복 가능케 하여, 향후 암 치료제 개발 분야에 활용될 전망이라고 밝혔다.
**당대사공학(metabolic glycoengineering) : 인공 당과 당단백질 합성과정을 이용한 세포 표면에 화학적 표지가 가능한 수용체를 도입할 수 있는 기술 /  생물직교성 무동 클릭화학(Bioorthogonal copper-free click chemistry) : 구리촉매 없이 두 분자의 반응 기간의 상호작용을 통해 두 분자를 특이적으로 연결하는 결합 반응

KIST 김광명 박사팀은 생체 내 암 조직에서 당대사공학을 통해 암 세포 표면에 인공수용체를 만들 수 있는 나노크기의 접합체(덴드리머-비천연당)를 제작했다.

<그림 2> 덴드리머 기반 비천연 당전구체 전달 모식도:PAMAM(덴드리머) 표면에 가수분해가 가능한 화학 작용기를 이용하여 비천연 당을 화학적으로 결합시킴. 표면에 비천연 당이 수식된 덴드리머는 암 조직에 전달되어 암 조직의 낮은 pH (6.5 이하) 조건에서 가수분해 되며 비천연 당을 방출시킴.

그리고 인공수용체에 생물직교성 클릭화학을 통해 특이적으로 결합 가능한 형광체를 지닌 인공막(리포좀, liposome)을 이용하여 암의 인공 표적 효능을 관찰했다. 연구진이 개발한 비천연당 전달 기술은 높은 생체 적합성을 지니며, 이질성을 갖는 암 세포를 균일하게 표적할 수 있는 특징이 있다. KIST 김광명 박사는 “본 연구에서 개발한 이질성을 갖는 암 세포 인공 표적 기술을 이용해 최적화된 약물전달이 가능하며, 향후 암 치료제 개발 분야 연구에 도움이 될 수 있을 것으로 기대한다”고 밝혔다.

<그림 3> 덴드리머 기반 비천연 당전구체를 이용한 다양한 암 세포의 표지 효능 평가:덴드리머 기반 비천연 당전구체 (Nano-MPs)를 이용하여 다양한 종류의 암 세포의 표지 효능을 평가함. 본 연구팀은 암 세포 이질성 환경을 모사하기 위하여 뇌암, 유방암, 폐암 등의 다양한 기원의 암 세포를 이용함. 기존의 암 표적화를 위해 사용되는 RGD (단백질), cetuximab (항체), folate (엽산 화합물)등의 리간드는 결합될 수 있는 특정 수용체가 발현되는 암 세포만 표적 할 수 있는 한계가 있었음. 본 연구를 통해 개발한 Nano-MPs는 암 세포의 이질성과 관계없이 표적화가 가능한 특성을 지님.

<그림 4> 덴드리머 기반 비천연 당전구체를 이용한 암 조직 표지 효능 평가:인공수용체에 생물직교성 클릭화학을 통해 특이적으로 결합 가능한 리포좀을 이용하여 이질성을 갖는 암의 표적 효능을 관찰함. RGD 리간드를 이용해 표지 할 수 있는 U87 암 세포 및 RGD 수용체가 거의 발현되지 않는 MCF7 암 세포를 동시에 접종한 동물 모델을 이용하여 본 연구를 통해 개발한 암 인공 표적 기술의 생체내 효능을 관찰함. 모델 나노입자로, 폴리에틸렌글리콜이 수식된 리포좀, RGD 리간드가 수식된 RGD 리포좀, 인공수용체를 표적하기 위한 BCN이 수식된 리포좀을 각각 동물 모델에 투여하여 근적외선 형광영상을 이용한 효능 평가를 실시함. RGD-lipo가 U87 암 조직에 특이적으로 표적하는 특성과 달리Nano-MPs를 처리한 암 조직에서 모두 강한 BCN-lipo의 형광이 나타났음. 이는 인공수용체가 U87 및 MCF7 암에 성공적으로 도입되었으며, 이를 이용해 좀 더 균일한 암 표적이 가능한 것으로 판단함.

본 연구는 과학기술정보통신부(장관 유영민)지원으로 KIST 기관고유사업으로 수행되었으며, 연구결과는 생체재료 분야의 국제학술지 ‘Biomaterials’ (IF:8.402, JCR 분야 상위 1%) 최신호(9월 18일)에 온라인으로 게재되었다.

 

 * (논문명) Nano-sized metabolic precursors for heterogeneous tumor-targeting strategy using bioorthogonal click chemistry in vivo
      - (공동 제1저자) 한국과학기술연구원 이상민 박사(현 원광대학교 약학대학 조교수)
      - (교신저자) 한국과학기술연구원(KIST) 김광명 박사(과제 실무책임자)
                       서울대학교 안철희 교수

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NGS: sequencing이란 무엇인가?

 

최근 차세대 염기서열 분석법(Next Generation Sequencing: NGS) 기술의 발달과 분석 비용의 하락으로 인해 질병 원인 유전자 분석 연구 외의  다양한 연구 분야에서 NGS가 보편적으로 활용되고 있으며, 의료계 및 산업계에서도 활발하게 사용되어지고 있다. 차세대 염기서열 분석법 이전, 사람의 몸을 구성하고 있는 DNA 서열을 모두 알고자 했던 과학자들은 DNA sequencing 기술을 연구했다. DNA sequencing 기술은 생화학적 방법으로 생명체의 모든 세포의 DNA 사슬을 구성하는 염기 A, T, G, C가 결합된 서열 순서를 분석하는 기술이다. 가장 원초적인 방법으로 Maxam-Gilbert법과 효소적인 방법인 Sanger법이 있다.

 

Maxam-Gilbert
 

출처 : https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/maxam-gilbert

Sanger sequencing이 나오기 전 Maxam과 Gilbert가 DNA 염기서열을 분석해내는 기술을 만들어냈다. 이중나선으로 꼬여 있는 DNA를 준비 한 뒤, 온도를 높여 denaturation(변성) 과정을 통해 단일 가닥의 DNA 가닥을 생성하고 5번 말단을 감마-32P를 사용하여 방사성 동위원소의 labelling을 시킨다. 그리고 화학적 반응을 이용해서 DNA 가닥을 특정 염기에서 분해시킨다. 예를 들어 dimethyl sulphate(디메틸 황산)는 선택적으로 purine계열의 A,G 염기를 공격하고 hydrazine(하이드라진)은 선택적으로 pyrimidine계열의 C,T를 공격한다. 그럼 이러한 화학적 시행을 통해서 G, A+G, C 그리고 C+T의 말단을 갖는 DNA가닥이 나눠지게 된다.

 

여기서 잠깐, DNA sequence를 구성하고 있는 염기 A,G,C,T 4가지 중 A,G는 퓨린계 염기, C,T는 피리미딘염기이다.  A+G는 DNA 염기서열에서 A가 있는 염기에서 DNA를 자르는데, 가끔은 G point 에서도 잘리는 것을 말한다.

 

서로 다른 4개의 reaction tube(반응관)에 다른 사이즈의 DNA 가닥을 놓고 고해상도 acrylamide gel(아크릴아미드 겔)을 이용하여 전기영동으로 가닥을 크기별로 분리하고 X-ray 필름을 gel 위에 둬서 방사선을 쏘이면 특정 band들이 보이게 되는데 이곳이 감마-32P로 label되어진 DNA 분자의 위치이다. Sequence는 gel의 밑 부분부터 읽기 시작하며, 4개의 화학 반응의 band pattern을 읽을 때, 예를 들어 G-reaction과 G+A-reaction lane에서 모두 band가 나타났다면 이것은 G 로 읽어야 하고, 만약 G+A-reaction lane에서만 band가 나타났다면 A로 읽어야 한다.

 

Sanger sequencing

생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)은 시험관 DNA 복제 중에 DNA 사슬을 마무리 하는 디디옥시뉴클레오티드가 DNA 중합효소에 의해 제한적으로 삽입된다는 원리에 기반한다. 최근에는 많은 양의 생어 염기서열 분석을 대규모로 자동 게놈 분석을 위해 NGS 방법이 진행되고 있으나, 더 작은 규모의 프로젝트와 NGS 결과의 검증, 길이가 긴 연속 DNA 염기서열 분석 (> 500 뉴클레오티드)을 위하여 아직까지 널리 쓰이고 있다.  Sanger sequencing은 고전적인 ‘사슬 종료 방법’을 이용하여 하나의 단일 나선 DNA 주형, DNA 시발체(primer), DNA 중합효소, 보통의 디옥시뉴클레오시드3인산염 (dNTP)와 DNA 나선연장을 종료하는 디-디옥시뉴클레오시드3인산염(ddNTP)를 쟤료로 sequencing을 진행한다.

출처 : https://www.youtube.com/watch?v=593zWZNwbJI

사슬 종료 뉴클레오티드(ddNTP)는 인산이에스테르 결합 형성에 필요한 3'-[OH]가 없어, 삽입되었을 때 DNA 중합효소가 DNA의 연장을 중단하도록 한다. 일반적인 d(A,C,G,T)TP만 넣어주면 DNA 중합효소는 이에 상보적인 DNA를 합성하게 되지만 소량의 dd(A,C,G,T)TP를 섞어주게 된다면, DNA polymerase가 중간에 ddNTP가 끼어 들어간 DNA 분자를 합성되게 된다. 그러면 이러한 분자는 더 이상 길어지지 않고 합성이 중단된다.

출처 : https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-dideoxynucleotide

DNA 샘플은 네 가지 경우로 나누어 dATP, dGTP, dCTP, dTTP는 각 시험관에 모두 첨가하고, 디디옥시뉴클레오티드 (ddATP, ddGTP, ddCTP 또는 ddTTP)는 시험관 4개중 각 1개의 종류만 첨가시켜 DNA 중합효소로 중합시킨다. 시발체에서의 주형 DNA 연장이 여러 차례 이루어지면 생기는 DNA 조각은 열 변성되고 겔 전기 영동 과정을 통해 크기별로 분리된다. 이들 ddNTP에는 각각을 구별할 수 있게 형광물질이 결합되어 있어 새로이 합성된 DNA들의 마지막 염기 종류에 따라 서로 다른 형광을 띄게 된다. 합성된 DNA 분자들은 4개 중의 어느 하나의 ddNTP가 끼어 들어갔으므로 정확히 한 염기씩 길이의 차이가 나게 된다. 이들은 전기 영동법에 의해 크기 순으로 나열할 수 있으며, DNA 띠들은 방사능 촬영이나 UV로 형광물질에 따라 특이적인 파장의 빛을 발하게 되어 순서대로 읽으면 원래 염기서열과 상보적인 서열로 보이게 된다.

 

 

출처 : https://binf.snipcademy.com/lessons/dna-sequencing-techniques/sanger-dideoxynucleotide

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Whole genome shotgun sequencing

출처 : https://www.slideshare.net/suryasaha/icar-ca-bin-delhi-bioinformatics

shotgun sequencing 기술은 원래 바이러스나 세균과 같은 작은 유전체 sequence를 알기 위해 사용되어졌으나 whole genome shotgun sequencing 기술이 등장하면서 크기가 크고 포유류의 전체 유전체를 서열화 하는데 응용되고있다. 이 기술은 긴 DNA 가닥을 sequencing 하는 방법으로 DNA sequence를 랜덤으로 깨서 작은 조각들을 많이 만들고 오버랩 되는 구역을 찾아서 전체 sequence를 읽어내는 방식이다. shotgun sequencing 기술은 원래 바이러스나 세균과 같은 작은 유전체 sequence를 알기 위해 사용되어졌으나 whole genome shotgun sequencing 기술이 등장하면서 크기가 크고 포유류의 전체 유전체를 서열화 하는데 응용되고있다. 이 기술은 긴 DNA 가닥을 sequencing 하는 방법으로 DNA sequence를 랜덤으로 깨서 작은 조각들을 많이 만들고 오버랩 되는 구역을 찾아서 전체 sequence를 읽어내는 방식이다.

 

Next Generation Sequencing(NGS)
 차세대염기서열분석법 (Next-generation sequencing; Massive parallel sequencing)은 유전체를 무수히 많은 조각으로 나눈 뒤 각각의 염기서열을 조합하여 유전체를 해독하는 분석 방법으로, 2004년 최초로 상용화된 후 현재까지 그 성능이 발전해왔다. Next-generation sequencing (NGS) 또는 Second-generation sequencing로 잘 알려진 차세대 염기서열 분석법은 Massive parallel sequencing을 일컫는 말로, ‘대용량 염기서열 분석법’, ‘대규모 병렬형 염기서열 분석법’으로 번역된다. NGS 분석법은 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 얻은 데이터를 생물 정보학적 기법을 이용해 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하고자 한다.  차세대 염기서열 분석기법은 2007년 Roche가 처음으로 NGS 장비를 출시한 이후, lllumina Solexa(社), Applied Biosystems(社) 등이 연이어 NGS 장비를 소개하였다. 현재의 Sanger 염기서열 분석 장비는 기껏해야 동시에 수십 개의 전기영동이 가능한 반면,  NGS 염기서열 분석 장비에서는 수십만 내지 수십억 개의 서로 다른 염기서열분석 반응이 동시에 진행되고 판독되어 유전체 분석에 소요되는 비용이 감소하고 있다.  장비마다 차이는 있으나 NGS 염기서열분석 과정은 검체 준비, 클론성 증폭, 염기서열분석의 3단계로 구성된다.

 

NGS 염기서열분석 과정
1) 검체 준비(sample preparation step)
 검체는 분석 대상 (유전체 전체, 엑솜, 특정 염색체 부위, 특정 유전자 조합)에 따라 포획법, 분절법 또는 증폭법 등으로 준비된다. DNA 절편은 읽기 적절한 길이로 준비되고, 여기에 동시 증폭 및 염기서열반응을 위한 adaptor가 결합된다.
2) 클론성 증폭(clonal amplification step)
 준비된 절편을 플레이트 위 일부 공간 또는 droplet(작은 물방울) 안에서 클론으로 증폭시킨다.
3) 염기서열분석(sequencing reaction step)
 클론성 증폭이 이루어진 수십만 내지 수십억 개의 반응산물의 염기서열을 동시에 분석한다. 위 과정은 장비에 따라 1일~1주가 소요되며, 한 번의 분석과정에서 최대 600 Gb의 염기서열 정보를 얻을 수 있다. NGS는 대용량의 정보를 제공할 수 있으므로, 전체 유전체 외에도 특정 유전자 조합 또는 특정 염색체 부위의 염기서열정보를 얻는데 사용될 수 있다.  또한  minor allele을 동시에 분석할 수 있고, 상대적 정량도 가능하므로, 미생물이나 종양처럼 기원이 다른 핵산이 혼합된 경우의 정량적 분석에도 사용될 수 있다.

출처 : http://www.koreahealthlog.com/news/articleView.html?idxno=17862

 

NGS 데이터의 특징
 NGS 데이터가 Sanger 염기서열분석 데이터와 다른 몇 가지 특징이 있는데, 첫 번째는 단일 가닥 염기서열분석(single strand sequencing)이다. Sanger 염기서열분석 데이터는 모든 세포의 DNA 염기서열의 총합으로 표현되는 반면, NGS 데이터는 각 세포에서 유래한 단일가닥 DNA 염기서열이 각각 독립적으로 표현된다. 바꿔 말해, NGS 데이터는 Sanger 데이터보다 polymerase error에 훨씬 취약하다는 약점이 있다. 따라서 NGS 데이터에서 특정 위치의 염기를 최소 몇 번 읽었는지(coverage depth), 염기변이의 빈도가 충분히 높은지가 중요하다.

두 번째, NGS는 대용량 데이터이다. 따라서 Sanger 데이터와 비교가 어려울 정도로 대용량의 정보를 얻을 수 있으나 분석 복잡도가 커서  빠른 속도의 분석 알고리즘이 필요하다.
세 번째, NGS의 기본 데이터 유형은 텍스트파일이다. Sanger에서는 전기영동을 통한 형광 종류별 강도 변화가 기록된 electropherogram이 주어지므로 텍스트 파일 외 각 peak 높이, peak간 간격, peak의 상대적 비율과 변화 등 다양한 정보를 통해 sequencing quality 및 분석소프트웨어의 분석 오류에 대한 직관적 파악이 가능하다. NGS도 장비에서 기록된 신호 데이터가 있지만, 매 사이클마다 한 번씩 형광으로 기록되고 sequencing quality에 대한 직관적 파악이 쉽지 않아 분석 소프트웨어의 분석 오류 발생 시 이를 파악하기가 어렵다.

 

이번 기사에서는 Sequencing의 역사와 차세대염기서열분석법, NGS에 대한 전반적인 준비과정과 데이터 특징들에 대해 알아보았다. 다음 기사에서는 NGS를 응용한 sequencing 방법들을 좀 더 자세히 이야기 하도록 하겠다.

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  1. 표절봇 2018.01.10 15:57 신고  댓글주소  수정/삭제  댓글쓰기

    NGS 파트는
    http://www.koreahealthlog.com/news/articleView.html?idxno=17862
    이 기사의 텍스트를 그대로 베껴서 썼는데
    그림출처만 달아놓고 이렇게 내도 되는 건가요?

분자진단의 어벤져스! 4가지 기술을 소개합니다!

 

 세포 내에서 일어나는 다양한 분자 수준의 변화를 평가할 수 있는 분자진단 기법에는 수많은 기술들이 있다. 이번 기사에서는 분자진단시장을 지배하고 있는 대표적 기술 네 가지를 소개해 보고자 한다. 네 가지 기술은 마이크로 어레이(microarray), ②형광 동소 교잡법(fluorescent in situ hybridization), ③중합효소 연쇄 반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), ④차세대 염기 서열 분석(NGS, Next-Generation Sequencing)이다.

출처 : https://www.quora.com/What-is-the-central-dogma-of-molecular-biology-Is-it-true

 우선 이 기술들에 대해 설명하기 전에 DNA와 RNA 그리고 단백질이 어떤 과정을 거쳐 세포 내에서 생성되는지 간단한 이론 한 가지를 소개하고자 한다.  ‘Central Dogma' 이론은 왼쪽 그림과 같이 DNA가 RNA로 혹은 기능을 갖고 있는 생산물인 단백질로 바뀌는 분자생물학적 과정과 유전 정보의 흐름을 잘 설명해 주는데, 이 이론에 따르면 DNA가 갖고 있는 유전정보는 전사(transcription) 과정을 통해 RNA로 바뀐다. 이때 DNA의 유전정보가 단백질로 만들어지는 과정에서 조금의 손상이라도 일어나게 된다면 그 DNA는 재사용할 수 없기 때문에 중간에서 이 일을 잘 처리해줄 매개체가 필요하다. 이 매개체가 바로 RNA이다. RNA는 크기가 매우 작은 메신저로 세포 소기관인 리보솜이라 불리는 단백질 합성 공장에 들어가 DNA의 유전정보를 잘 해석하여(translation) 단백질을 만들어 낸다.

 

 첫 번째로 설명할 분자진단 기술은 “Microarray”이다. 이 기술은 대량으로 전사된 전사체의 발현 상황을 총체적으로 빠르게 분석할 수 있는 방법이다. 샘플을 준비해서 RNA를 추출하고 이 RNA에 역전사* 효소를 사용하여 cDNA**를 합성한다.
*전사가 DNA에서 RNA로 진행되어진 거라면 역전사는 유전정보가 RNA에서 DNA로 가는 것을 의미한다.
**cDNA : complementary DNA의 약자로, Reverse transcription(역전사)을 통해 mRNA로부터 합성되어진 분자
 DNA가 RNA보다 일반적으로 안정하므로 혼성화(hybridization)를 위한 단일 가닥(single strand)의 핵산을 RNA로부터 역전사 된 cDNA로 준비하여 마이크로 칩의 상보적인 염기서열과 혼성화시키는 원리를 기본으로 한다. Microarray slide 한 장에 고정시킬 수 있는 cDNA의 수가 수백 개에서 많게는 수 만개이므로 이 기술을 통해 수 만개 유전자의 발현 양상을 동시에 살펴볼 수 있다. cDNA가 합성되면 각각 다른 형광 염색(dye)을 통해 control과 sample을 표지하고 cDNA는 이중 나선 이기 때문에 이중 가닥을 단일 가닥으로 만들어주는 과정을 거쳐 칩에 있는 probe와 혼성화를 시켜주어 형광을 감지한다. Microarray 방법을 통해 샘플에서 추출해 낸 mRNA 수치가 항상 단백질의 양을 대변하는 것이 아니고, 정밀도가 떨어지기 때문에 반정량적인 기술이라는 한계점을 갖고 있다. 게다가 chip위에 존재하는 probe(탐칩)하고만 결합하기 때문에 chip 내에 일치하는 서열이 없다면 전사체의 전체적인 것을 알 수 없게 된다. 또한, hybridization*** 과정에서 교차혼성화(cross- hybridization)로 인한 noise가 발생할 수 있어 정확한 진단방법으로는 사용할 수 없다.
***형광물질을 염색체에 부착시키는 검사과정을 교잡반응(hybridization)이라 부른다.

출처 : http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/cdna-and-microarrays.html

 두 번째, 형광동소교잡법(fluorescent in situ hybridization)기술은 형광동소교합법, ‘FISH’로도 많이 불린다. 이 방법은 특정 DNA 염기서열의 존재유무를 규명하기 위하여 세포배양이나 DNA의 추출과정을 거치지 않고 염색체나 핵의 형태를 그대로 유지한 채 진행된다. 세포를 슬라이드에 도말하고 관찰하고자 하는 표적유전자의 특정 염기서열과 상보적인 DNA에 형광물질을 붙인 후 여러 종류의 탐침자(probe)****와 반응시켜 해당 표적유전자가 존재하는지, 존재한다면 그 위치를 확인함으로써 염색체나 유전자의 변이를 형광현미경으로 관찰하는 방법이다.
****무엇인가 원하는 것을 찾아내는 역할을 하는 매개체
실험 순서는 다음과 같다.

출처 : http://blog.daum.net/bioand/848

우선, 염색체 표본을 Slide Glass에 올려놓고 준비한 Probe DNA를 표본이 있는 Slide Glass에 실험에 필요한 시약들과 함께 첨가한다. 이중가닥 (Double Strand) DNA를 변성(Denaturation) 과정을 통해 단일가닥 DNA로 풀어줌으로서 교잡반응 과정을 준비한다. 교잡반응을 통해 단일가닥으로 변한 Probe DNA가 Sample DNA와 결합하게 되고 세정 과정을 통해 결합하지 않은 잔여 DNA를 제거한 뒤 형광을 확인한다. 따라서 종양임을 증명, 질환 분류, 종양의 재발 추적, 암유전자 위치연구, 기저 유전질환의 확인 등으로 응용할 수 있다. 대표적인 예로 혈액 종양 형광동소교잡법 검사는 혈액종양에서 수 백 개 이상의 세포 중 유전자 재배열을 가진 악성세포를 정확하게 정량 분석함으로서 추적 및 예후 판정에 도움을 준다. 형광동소교잡법이 정량적 분석뿐만 아니라 형태학적 관찰과 함께 검사 소요시간 단축, 간기 세포의 분석이 가능하다는 특징을 갖고 있으나, 검사시약이 고가이고, probe에 대한 결과만 알 수 있다는 한계가 있다.

 세 번째, PCR(polymerase chain reaction)은 내열성 DNA 중합효소를 이용하여, 특정 유전자를 분석 혹은 유전자 조작 가능한 수준으로 증폭하는 방법이다. 이 방법은 온도 순환(cycling)을 통하여, 증폭 부위 양 말단에 해당하는 염기서열을 가진 primer***** 쌍이 증폭 대상 DNA에 결합하고, 중합되고, 다시 떨어지는 과정을 반복하면서 특정 부위의 DNA를 기하급수적으로 합성해내는 과정을 말한다.
*****프라이머 : DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열(짧은 가닥의 RNA)로 DNA 복제과정에서 DNA합성에 이용됨

 

출처 :http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=jintaeky&logNo=220270279599

 마지막 차세대 염기서열 분석(NGS, Next-generation sequencing) 기술은 DNA 서열을 조각내어 빠르고 정확하게 읽어내는 방법으로 유전체 해독에 소요되는 비용과 시간을 획기적으로 줄여준다. 기본적으로 DNA 서열을 증폭해 형광 표식 등을 카메라로 찍고 이를 이미지 처리함으로써 염기를 읽어 낸다. 다음과 같이 NGS 샘플 준비 과정이 끝나면 데이터 분석을 하게 되는데 크게 ‘pre-processing’, ‘assembly’, ‘assembly를 이용한 이차 분석’으로 나누어진다. Pre- processing 단계에서는 다양한 플랫폼으로부터 서열화(sequencing)된 정보를 모으는 (assembly) 단계에 적용하기 위한 작업을 수행하고, 분석의 방향과 목적에 맞게 assembly를 수행한다. 이 후 assembly 결과를 이용한 variation 분석, binding site 분석, expression 분석 및 전체 정보에 대한 다양한 이차정보를 분석하게 된다.

출처 : https://www.abmgood.com/Next-Generation-Sequencing-Service.html

 Sanger sequencing을 1세대 Sequencing으로 하여 현재는 4세대까지 발전되었고, NGS는 다양한 응용분석이 가능하므로 염기서열 분석 외에도 유전자 발현분석, epigenetics 분석, metagenome분석 등이 가능해 다양한 연구목적에 효율적으로 적용되고 있다.  분자진단이 유전체 검사를 통해 질병 감염여부를 확인하는 등 조기진단을 통한 예방과 효율적인 치료에 큰 도움이 되는 분야인 만큼 다양한 기술들의 발전이 곧 분자진단시장의 새로운 시대를 열 것이라 생각한다.

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혈액을 떠다니는 DNA

 

‘피’라고 불리는 혈액은 몸 안의 세포에 산소와 영양소를 공급하고 세포의 신진대사에 의해 발생하는 이산화탄소와 노폐물을 회수하여 운반하는 체액이다. 혈액은 결합 조직의 한 종류로 고체 성분의 혈구와 액체 성분의 혈장으로 구성되어있다. 혈구는 혈소판과 백혈구, 적혈구로 이루어져 있으며 혈장은 섬유소원과 혈청으로 구성되어있다.

출처 : http://www.skchemicals.com/ls/kor/pharm/info11.html

 우리 눈에 빨간 액체로만 보이는 혈액은 상당히 많은 물질들로 구성되어있고, 전문의들에게 다양한 의학적 정보들을 제공해준다. 특히 혈액검사는 의료 행위 중 질병 유무, 의약품의 효과, 무기질 영양상태, 생화학 및 생리적 상태를 검사하는 등 다양한 분야에 활용되고 있다. 


 이러한 혈액검사방법의 발전은 ‘피 한 방울로 난치병 진단이 가능하다면 얼마나 좋을까?’라는 생각을 현실로 만들었다. 기존의 조직생체검사 방식은 몇 가지 단점이 있다. 일반적으로 암 덩어리의 유전자 염기서열을 분석하면 수많은 돌연변이들이 발견되고, 예상보다 더 넓은 폭의 유전적 다양성이 나타난다. 한쪽 언저리의 암세포는 다른 쪽에 위치한 암세포와 유전적으로 달랐으며 암 덩어리 전체에서 공통된 돌연변이를 갖고 있는 암세포는 고작 30% 정도였다. 따라서 암의 모든 면을 대변해줄 수 없는 한계를 갖고 있는 것이다. 반면 새로운 기술인 액체생검(Liquid Biopsy)은 혈액 한 방울이면 암 진단까지도 가능하다. 액체생검은 혈액뿐 만 아니라 소변이나 침 등 체액 속 DNA에 존재하는 암세포 조각을 찾아 이에 대한 유전자 검사나 분석을 진행하는 기술이다. 조직 검사에 비해 빠르고 간편하며, 종양세포 특유의 돌연변이 등을 분석하기 때문에 ‘거짓 양성’의 가능성이 낮다는 장점이 있다.
☞ 여기서 잠깐! 거짓 양성이란, false positive라 불리며 본래 음성이어야 할 검사 결과가 양성으로 잘못 나오는 것을 얘기한다.

출처 : http://liquid-biopsy.gene-quantification.info/

 또한‘표준생검(Standard biopsy)’과 다르게 액체 생검은 천자나 절개 등의 침습적인 시술 없이 혈액이나 복수 등 체액에 존재하는 암세포 유래 핵산을 분석하는 비침습적인 방법이어서 기존의 침습적인 조직검사 방법의 대안으로 주목받고 있다. 여기에 더해 액체 생검은 환자로부터 비교적 간편하게 체액을 채취하여 암 발생 및 전이 여부를 신속하고 상세하게 파악할 수 있고 유전체 분석 기술의 급속한 발전과 비용 절감으로 빠른 시일 내에 상용화가 될 것으로 기대하고 있다.
 액체 생검의 원리는 다음과 같다. 암세포가 파열되어 사멸하는 경우 그 찌꺼기가 혈류 속으로 방출되는데, 그 속에서 종양의 DNA, 즉 혈류 속을 순환하는 종양 DNA가 포함되어 있다. 이를 cell free DNA(cfDNA) 좀 더 자세히 말해, cell free tumor DNA(ctDNA)라고 부른다. Cell free DNA는  cell에서 유래된 DNA와 같은 핵산들이 자유롭게 혈류 속을 돌아다닌다 하여 불러지게 되었다. 정상적인 세포의 찌꺼기는 대식세포라 불리는 면역계 관련 세포들이 잘 수거하여 처리하지만, 종양은 덩치가 너무 크고 신속히 증식하기 때문에 대식세포의 처리 능력을 넘어서게 된다. 따라서 혈류 속에 떠돌아다니는 ctDNA를 포착할 경우 종양의 동태를 파악하는 결정적 단서를 얻을 수 있다.
 Cell free DNA를 연구 목적으로 이용할 때 두 가지의 주요한 문제점이 있다. 첫 번째는 백혈구로부터 나오는 genomic DNA의 오염 문제이고, 두 번째는 떠다니는 DNA의 양이 미량이라는 것이다. 따라서 혈액을 채집하여 cfDNA를 추출하는 과정이 매우 중요하다.
  이 때 사용되는 간단한 방법이 원심분리다. 환자의 혈액을 채취하여 원심분리를 하게 되면 plasma layer, buffy layer, 적혈구 layer 등 총 3개의 층이 분리된다. Plasma 층에 cell free DNA가 존재 하므로 나머지 층을 다 제거하고 plasma 층만을 분리하여 10,000g 이상의 힘으로 10분간 다시 원심분리를 시켜 남은 cell들과 찌꺼기들을 제거시켜준다. 그리고 plasma 층에 있는 cell free DNA 추출을 위해 –20℃ 이하에서 냉동보관한 후 Qiagen’s QIAamp circulating nucleic acid kit를 이용해 cell free DNA를 추출한다. Plasma층만을 분리한 뒤, 보관할 때에는 STREAK tube를 이용하여 저장한다. 이 tube는 핵산을 보호해 주는 인자들이 포함되어 있어 cell free DNA를 분석하는데 안정적이다. 특히 백혈구로부터의 오염을 보호하고 genomic DNA의 방출을 막아 높은 순도의 cell free DNA를 추출하여 최대 14일까지 보관할 수 있다.

☞ 여기서 잠깐! 원심분리란 축을 중심으로 물질을 회전시켜서 원심력을 가해 혼합물을 밀도에 따라 분리해내는 원리를 말한다. 
 

 위에서 언급한 과정은 다양한 종류의 추출 과정 중 하나이다. Cell free DNA를 추출하는 kit들의 종류도 다양하다. 앞서 언급한 QIAamp circulating nucleic acid kit외에도 ZR Serum DNA kit, Norgen’s plasms/serum cell-free circulating DNA kit, EpiGenTek’s FitAmp kit, Chemagen’s circulating NA kit등이 있다.
 여러 kit들 중에서 cfDNA를 추출하는데에 Qiagen kit가 가장 많이 사용된다. Qiagen 회사의 QIAamp circulating nucleic acid kit는 spin column processing 원리를 이용하여, lyse(용해), bind(묶음), wash(세정), elute(추출) 4가지 단계로 진행된다. 오염물질을 제거할 수 있도록 특수하게 고안되어진 완충기와 막을 사용하여 액체상태의 반응물에서 DNA 절편을 정제한다. DNA를 구성하고 있는 인산염의 음전하로 인해 tube의 막과 고염도 환경에서 화학적 결합이 진행되는 것이 spin-column을 이용한 DNA정제의 기본원리가 된다.
☞ 여기서 잠깐! spin-column은 하단 왼쪽에 있는 tube를 이야기 한다. 

출처 : http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0136133

 

  Spin column 형태이므로 별도의 실험기기 없이 원심분리기만을 사용하여 15분 내에 모든 샘플을 처리할 수 있으며 각종 오염물질을 제거하고, DNA 정제, 제한효소 반응과 같은 효소반응물로부터 다양한 종류의 효소를 제거하고자 할 때 이용된다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 절편은 복제와 염기서열분석으로 확인할 수 있으며, Spin-column을 사용한다고 순도가 향상되는 것은 아니고 사용하는 시약의 조건이나 cell의 종류/상태, DNA의 종류/상태, bind(묶음)/wash(세정) 조건 등에 따라 달라질 수 있다.

출처 : http://www.canspecsci.com/pdshowtwo/productshow_6809805.html

그러나 아직 혈액을 활용한 액체생검은 의료현장에서 진정한 의미의 진단으로 인정받고 있지 못하다. 다만 최근 몇 년 차세대염기서열분석(NGS·Next generation sequencing) 등 유전자 분석 기술이 발전하고 비용도 낮아지면서 액체생검 기술들이 다시 떠오르고 있는데 아직 전 세계적으로 초기 단계이며 동반진단용과 조기진단용 기술을 속속 선보이고 있다.   염기서열분석 장비의 대표기업인 미국 일루미나, 국내 지노믹트리, 파나진, 분자진단 기업 씨젠과 유전체 정밀의학 기업 마크로젠 등도 액체생검 시장 진입에 힘쓰고 있다. 많은 학자들이 지속적으로 암이 치료에 반응하는지, 항암제에 내성이 생겼는지, DNA 변이가 발생했는지, 치료 후 암이 재발했는지를 계속적으로 연구하고 있는 만큼 하루빨리 간단한 혈액검사로 진단할 수 있는 시대가 왔으면 한다.

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  1. Dr.정 2017.07.11 12:00 신고  댓글주소  수정/삭제  댓글쓰기

    이 분야 연구자도 아닌데 이 글은 너무 흥미가 ^^ 아니 이 분야가 아니라 그런건가
    그래서 타이틀이 취향저격인가요 ㅎ

  2. 김미연 2017.07.21 11:20 신고  댓글주소  수정/삭제  댓글쓰기

    재미있게 보셨다니 정말 감사합니다! 다음 기사는 더 흥미로운 주제로 찾아뵐께요:)

  3. 고독한dna쟝 2017.08.28 17:21 신고  댓글주소  수정/삭제  댓글쓰기

    글 잘 보았습니다. 마이크로바이움과 풀디앤에이시퀀싱을 합친 퓨전 정밀의료도 있는 지 궁금하네요 선천적. 후천적 모두를...쿨럭

분자 진단이 바로 히트다 히트!

 

진단은 의사가 환자의 병 상태를 판단하는 일을 말합니다. 좀 더 쉽게 진단을 알아보려면 우리 생활 속에 이미 존재하고 있는 간편 진단기기 들을 보면 됩니다. 하나의 예로서 임신 초기 여성들이 임신 여부를 확인하기 위해 사용하는 ‘자가 임신 진단기’입니다. 자가 임신 진단기는 소변을 통해 임신 여부를 판별하는 기구로 진단시약으로 분류됩니다. 자가 임신 진단기는 소변에 HCG(인간 융모성생식선 자극호르몬)라는 호르몬이 포함되어 있는지를 통해 임신 여부를 판단합니다. 임신을 하지 않은 여성은 체내 HCG의 농도가 매우 낮게 나타나고, 임신한 여성은 체내의 황체뿐만 아니라 태아의 태반 조직에서 HCG가 분비되어 임산부에게 유입되므로 HCG의 농도가 높게 검출됩니다. 그래서 임산부의 소변을 통해 HCG가 나오게 되면 자가 임신 진단기는 항원 항체 면역반응을 이용하여 HCG를 검출하는 방식으로 임신여부를 진단하게 됩니다. 이렇게 생활 속 가까이에서 여러 진단방법과 진단기들이 우리의 건강 상태와 감염 여부를 간편하게 확인 시켜줍니다.

출처 : http://koc.chunjae.co.kr/Dic/dicDetail.do?idx=29089

☞여기서 잠깐 : 항원이란 우리 몸 밖에서 유입되어진 외래 물질, 병원균을 말하며 항체는 그 항원을 약화시키기 위해 인체의 면역계에서 만든 방어물질입니다. 
 

http://m.media.daum.net/m/channel/view/life/20160705040408065

인간의 질병을 감지할 수 있는 진단으로는 체내진단과 체외진단, 두 가지가 있습니다. 체내진단은 어원 그대로 몸속을 들여다보고 질병의 원인과 증상을 파악하는 진단방법입니다. 대표적으로 X선과 CT촬영, MRI와 같은 이미징 테크닉이 있습니다. 체외진단은 소변, 혈액, 조직세포 등을 통해 질병의 원인을 분석하는 방법입니다. 좀 더 세분화시킨다면 체외진단은 면역화학적 진단, 자가 혈당 측정, 현장진단, 분자진단, 혈액진단, 임상 미생물학 진단, 지혈진단, 조직진단 등 총 8개 분야로 나눌 수 있습니다. 연평균 성장률과 시장점유율로 볼 때, 면역 화학적 진단, 현장진단, 자가 혈당 측정, 분자진단이 가장 많이 사용되는 분야입니다. 이런 진단방법들은 환자의 시료를 추출하여 체외에서 여러 정성 및 정량 기술을 적용한 후 질병 상태를 판단하는 방식을 주로 사용합니다. 체내진단은 아직까지도 상해를 입거나 몸에 이상이 있을 때 가장 보편적으로 검사하는 방법이지만, 체외진단 시장 역시 계속해서 빠르게 성장을 하고 있습니다. 

 인체는 단백질, 지방, DNA와 RNA 등으로 구성되어 있습니다. 그 중 유전정보를 담고 있는 상자, DNA와 RNA로 질병을 확인하는 것을 ‘분자진단’이라고 합니다. 분자진단은 체외진단의 대표적인 진단 기술로 유전자 정보가 들어 있는 DNA 혹은 RNA에서 일어나는 분자 수준의 변화를 영상, 수치를 통하여 검출해 진단하는 기법입니다. 한마디로 말해 DNA와 같은 유전자를 이용한 정확한 질환 진단 검사법입니다. 질병 감염 여부 등을 판단할 목적으로 혈액, 소변, 타액 등 인체에서 유래하는 검체로부터 분자생물학적 기술을 이용하여 감염 물질(균, 바이러스)의 유전 정보를 담고 있는 유전자(DNA나 RNA)를 검사하며 소변검사나 혈액검사보다 정확도가 높고 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점을 갖고 있습니다. 게다가 분자진단을 통해 주요 질병을 조기에 진단할 수 있게 되었습니다.
 분자진단시장이 성장하기 전엔 ‘면역진단법’을 많이 써왔습니다. 면역진단법은 앞서 말했던 자가 임신 진단기와 비슷한 원리(항원·항체반응)로, 질병에 의해 생성되는 항체 등 간접인자를 검사하는 것입니다. 테스트 당 비용이 낮고 간편하여 시장 규모는 크지만, 응용되는 분야가 감염성 질환에만 국한되고 질병을 조기에 진단하는 것이 어려워 민감도가 떨어지는 기술입니다. 하지만 분자진단법은 면역 진단법과는 다르게 질병의 조기 진단이 가능할 뿐만 아니라 응용분야가 감염성 질환을 더불어 암 진단, 맞춤의학으로도 이용될 수 있으며 질병원인인 DNA나 RNA를 직접 검사할 수 있어 조기진단과 높은 민감도로 정확합니다. 분자진단시장은 주로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 기반으로 하여 실행됩니다. PCR은 Polymerase Chain Reaction의 약자로서, 중합효소 연쇄반응이라 하며, 유전정보를 갖고 있는 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 기술입니다. 원리가 극히 단순하고, 쉽게 응용할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 식품과학, 환경과학, 고고학, 인류학에 이르는 분야까지도 그 활용범위가 넓습니다. 

출처 : http://www.yourgenome.org/facts/what-is-pcr-polymerase-chain-reaction

PCR 반응조건은 통상적으로 다음 세 가지 반응단계로 진행됩니다. DNA 변성 단계, Primer annealing 단계, 신장 단계입니다. PCR을 실행하기 위한 준비물들을 모두 준비한 다음, 다음과 같은 과정을 통해 특정 DNA나 RNA를 대량으로 증폭시킵니다.

출처 : http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/pcr.html

우선 DNA변성(Denaturation)단계에서는 두 가닥으로 꼬여있는 DNA를 94℃에서 15~30초간 처리하여 각각 한 가닥 DNA로 분리시킵니다. 이렇게 열처리에 의해 한 가닥으로 변성된 DNA와 설계한 primer를 공존 시킨 후 온도를 낮추면 2종류의 primer는 각각 상보적인 한 가닥 주형 DNA에 붙게 되는데 이 과정을 primer의 annealing 단계라 합니다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing 합니다. 마지막으로 분리된 DNA에 달라붙은 primer가 DNA polymerase 효소의 증폭 활성을 이용해 primer가 신장됩니다. 이 과정을 Extension, 즉 신장반응이라고 합니다. 신장반응에 필요한 시간은 DNA의 농도, 증폭 단편의 길이 등에 따라 다르지만 일반적으로 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서 30초~10분간 처리합니다.
  PCR을 통해 원하는 DNA영역을 사이에 둔 2종류의 primer를 이용, tube내에서 연속적인 효소반응으로 증폭시킨다면 DNA polymerase에 의한 주형 특이적인 DNA 합성을 반복하게 되고 목적하는 DNA 단편을 최종적으로 수십만 배 증폭시킬 수 있습니다. 따라서 PCR을 이용하여 분자진단검사를 하게 되면, DNA와 RNA 등의 핵산을 분석해 질병을 찾아낼 때 극소량의 시료로도 빠르게 결과 도출을 할 수 있게 됩니다. 

출처 : https://www.abmgood.com/marketing/knowledge_base/polymerase_chain_reaction_introduction.php


 분자진단은 PCR등을 이용하여 기존의 일반적인 진단방법보다 민감도가 뛰어날 뿐 아니라 감염병, 유전병, 암 진단은 물론 질병의 특성과 관련한 여러 정보를 제공할 수 있습니다. 즉 분자진단은 민감도, 특이성, 정확도가 우수하여 완벽한 재현성을 가진 방법으로 정량적인 결과를 산출함으로써 예후진단과 치료효과 분석에 좋은 platform으로 활용될 것입니다.

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