PCR, 넌 어디까지 알고 있니?

 

PCR(polymer chain reaction)은 원하는 DNA의 sequence를 통해 다량의 DNA를 증폭하는 기술이다. Denaturation, Annealing, Extension의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 DNA template, primer, dNTP, polymerase등으로 구성되어 진행된다. 오늘은 유전자를 증폭시키는 PCR의 여러 가지 종류를 파헤쳐 보고자 한다.

 

1) RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.thermofisher.com

특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 뒤, PCR 증폭을 시행하는 기술이다. 실험 과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, 2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 노던 블롯 혼성화 분석(Northern blot hybridization)과 같은 방법을 사용하는 RNA 분석보다 실험방법이 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 복제(cloning) 할 수도 있다.

 

2) Allele-specific PCR
 DNA상에서 하나의 염기만 다른 SNP(single-nucleotide polymorphisms, 단일염기변이)를 분석하는 기술로서 서로 다른 allele의 DNA sequence만 안다면 primer를 제작하여 allele-specific PCR을 진행할 수 있다. Allele-specific PCR은 template과 SNP-specific primer사이에 불일치(mismatch)의 존재를 정확하게 판단하여 기존의 PCR에서의 비특이적인 증폭(amplification)을 막아 성공적으로 원하는 template만을 증폭 시킬 수 있다.

출처 : https://www.slideshare.net/

 

 

3) Asymmetric PCR
 Asymmetric PCR은 비대칭의, 불균형의 의미를 갖는 Asymmetric이란 단어에서 알 수 있듯이, 이중가닥의 DNA 중 한 가닥의 DNA만을 증폭시키는데 사용하는 기술이다. Single strand만을 얻을 목적으로 사용되며, Primer를 두 개 사용한다. 두 primer의 농도를 100:1로 섞어 PCR을 진행하는데, PCR 초기단계에서 한쪽의 primer는 소비되어 버리고 과잉의 primer에서 single strand DNA가 생성이 된다.

출처 : https://www.researchgate.net/

 

4) RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 

출처 : https://www.slideshare.net/

cDNA를 복제(cloning)하기 위해서는 cDNA library를 검사(screening)하는 방법이 가장 일반적이지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전체 cDNA를 얻어낼 수 있다. 반복 작업이 필요한 만큼 상당한 시간과 노력이 소모되는 작업이고, 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우엔 더욱 힘든 작업이 되어 버린다. 이 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 RACE(rapid amplification of cDNA ends) PCR 기술을 만들어 냈다. cDNA의 일부 염기서열만 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR 반응(reaction)을 통해 5'-end 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE PCR 방법에서는 모든 mRNA 3'-end에 존재하는 poly(A) tail(AAAAAAAA...AAAA-3')을 이용하여, 그와 상보된 oligo-(dT) primer(5'-TTTTTT...TTT-3')를 반응시켜 cDNA를 합성 시킬 수 있다.

 

5) IS-PCR(In Situ Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.slideshare.net/

 PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 민감성(sensitivity)과 ISH의 특정성(specificity)을 고루 갖추고 있다. IS-PCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, 슬라이드 글라스(slide glass) 등의 사용에 적합한 IS-PCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.  IS-PCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl(염화수소, 강산), proteinase K(단백질분해효소) 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 적절한 선택과 사용이 중요하다. 아직까지는 IS-PCR 방법의 효율이 기대효과 대비 그다지 높지 못하지만, 민감성과 특정성이 높아야 되는 진단 및 분석 분야에서는 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 

 

6) Hot start PCR
 Taq1 polymerase 효소는 37℃에서도 효소 활성이 좋기 때문에 간혹 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가 DNA 분자에 붙어 증폭(extension)되는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 결합(annealing)이 일어날 경우 primer의 불일치 접합 확률이 높고, 결과적으로 정확도가 떨어지는 결과를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot-start PCR기술이다. Hot-start PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에야 PCR이 진행되게 필요한 물질(ex. polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. 그러면 primer가 불일치하는 DNA 분자와 붙는 상황을 피할 수 있어 상대적으로 명확한 결과를 얻을 수 있다.

출처 :https://us.bioneer.com/

 

7) RAPD PCR 

출처 : https://www.researchgate.net/

 RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다. PCR을 진행할 때 primer가 짧을 경우 게놈(genome)상의 이곳저곳에 달라붙어 여러 조각(fragment)을 생성하게 되고, 전기영동을 사용하면 생명체마다 각각의 독특한 band를 형성하게 되는데, 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이며, 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이가 나타날 것이다. 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬워 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 확인하기 위해 사용된다.

 

8) Real time qPCR(quantitative PCR)
 PCR 산물의 양을 실시간으로 측정하기 위해 사용되는 기술이다. DNA, RNA, cDNA의 양을 정량적으로 분석할 수 있고, 한 샘플에서 PCR 산물의 copy 수를 측정할 수 있다. RT-qPCR 방법에서는 형광염색법(dye)을 사용하는데, SYBR-green, Evagreen 혹은 DNA probe를 가진 형광, Taqman을 이용해 실시간으로 증폭되는 산물의 양을 정량적으로 측정한다.

 

9) Nest PCR 
 Nest PCR은 한 번 PCR로 증폭한 DNA 단편을 한 번 더 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 방법이다. 두 개의 서로 다른 primer set를 이용하여 연속적으로 두 번의 PCR을 진행하게 되면 비특이적 반응을 감소시킬 수 있어 정확하고, PCR을 2회 실시하므로 감도가 상승하는 효과를 얻을 수 있다.

출처 : https://en.wikipedia.org/wiki/Nested_polymerase_chain_reaction

10) Multiplex PCR

출처 : https://www.labce.com/pcr_fundamentals.aspx

한 번의 PCR로 서로 다른 여러 개의 DNA들을 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. 반응시킬 용액에 서로 다른 DNA를 증폭시킬 primer를 첨가해 target sequence에 붙을 수 있도록 PCR 조건을 잡아주면 한 번에 증폭되어 상당한 시간과 노력을 절약할 수 있다. 그러나 한 번에 여러 가지 target을 증폭시키기 때문에 각 primer set들의 annealing 온도를 비슷한 범위에서 최적화 시켜야 되는 전처리 작업이 필요하다. Multiplex PCR은 병원균 확인, SNP genotyping, 돌연변이 분석, template의 양, RNA를 detection 하는데 유용하다.

 

11) Inverse PCR 
 Inverse PCR은 이미 서열을 알고 있는 DNA의 양 옆에 서열을 알지 못하는 부분을 알고자 할 때 많이 이용된다. 예를 들어 5’-xxxxxxx=========xxxxxx-3’ (x서열을 모름, =서열을 알고 있음)
이런 염기 서열에서 x 부분을 알고자 할 때 사용되는데, 제일 먼저 제한 효소로 자르고, 자른 부위를 원으로 만든다. 그리고 그 원으로 된 곳에primer를 붙이는데, 이 때 연장(elongation)과 같은 방향으로 가도록 primer를 붙인다. Inverse라는 말은 primer가 기존의 PCR과는 다른 방향으로 간다고 해서 붙여졌다.

출처 : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/da/Inverse_PCR_2.png

이 외에도 더 많은 PCR 종류들이 산업, 의학, 과학, 농업 등 다양한 분야에서 사용되어지고 있으며, 더 효율적인 PCR 기술들이 현재도 개발되고 있다. PCR은 분자생물학의 표준 실험법으로 특정한 유전자를 증폭하여 유전형을 알아보는 것부터, 신종플루, HIV, 지카바이러스, 콜레라균 등 온갖 병원균을 검출하고 종류를 확인할 때, 변사체의 신원을 분석할 때, 네안데르탈인의 뼈에서 추출한 DNA로부터 현생인류와의 관련성을 찾아 볼 때 등 굉장히 다양한 분야에서 적용되고 있다. 전 세계 PCR 시장의 규모와 PCR 기반 기술로 작동하는 차세대 시퀀싱 시장들이 200억 달러 이상의 규모가 될 것이라는 예상처럼, PCR은 현대문명을 구성하는 하나의 핵심적인 기술인 것이다.

Posted by KIST PR

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분자 진단이 바로 히트다 히트!

 

진단은 의사가 환자의 병 상태를 판단하는 일을 말합니다. 좀 더 쉽게 진단을 알아보려면 우리 생활 속에 이미 존재하고 있는 간편 진단기기 들을 보면 됩니다. 하나의 예로서 임신 초기 여성들이 임신 여부를 확인하기 위해 사용하는 ‘자가 임신 진단기’입니다. 자가 임신 진단기는 소변을 통해 임신 여부를 판별하는 기구로 진단시약으로 분류됩니다. 자가 임신 진단기는 소변에 HCG(인간 융모성생식선 자극호르몬)라는 호르몬이 포함되어 있는지를 통해 임신 여부를 판단합니다. 임신을 하지 않은 여성은 체내 HCG의 농도가 매우 낮게 나타나고, 임신한 여성은 체내의 황체뿐만 아니라 태아의 태반 조직에서 HCG가 분비되어 임산부에게 유입되므로 HCG의 농도가 높게 검출됩니다. 그래서 임산부의 소변을 통해 HCG가 나오게 되면 자가 임신 진단기는 항원 항체 면역반응을 이용하여 HCG를 검출하는 방식으로 임신여부를 진단하게 됩니다. 이렇게 생활 속 가까이에서 여러 진단방법과 진단기들이 우리의 건강 상태와 감염 여부를 간편하게 확인 시켜줍니다.

출처 : http://koc.chunjae.co.kr/Dic/dicDetail.do?idx=29089

☞여기서 잠깐 : 항원이란 우리 몸 밖에서 유입되어진 외래 물질, 병원균을 말하며 항체는 그 항원을 약화시키기 위해 인체의 면역계에서 만든 방어물질입니다. 
 

http://m.media.daum.net/m/channel/view/life/20160705040408065

인간의 질병을 감지할 수 있는 진단으로는 체내진단과 체외진단, 두 가지가 있습니다. 체내진단은 어원 그대로 몸속을 들여다보고 질병의 원인과 증상을 파악하는 진단방법입니다. 대표적으로 X선과 CT촬영, MRI와 같은 이미징 테크닉이 있습니다. 체외진단은 소변, 혈액, 조직세포 등을 통해 질병의 원인을 분석하는 방법입니다. 좀 더 세분화시킨다면 체외진단은 면역화학적 진단, 자가 혈당 측정, 현장진단, 분자진단, 혈액진단, 임상 미생물학 진단, 지혈진단, 조직진단 등 총 8개 분야로 나눌 수 있습니다. 연평균 성장률과 시장점유율로 볼 때, 면역 화학적 진단, 현장진단, 자가 혈당 측정, 분자진단이 가장 많이 사용되는 분야입니다. 이런 진단방법들은 환자의 시료를 추출하여 체외에서 여러 정성 및 정량 기술을 적용한 후 질병 상태를 판단하는 방식을 주로 사용합니다. 체내진단은 아직까지도 상해를 입거나 몸에 이상이 있을 때 가장 보편적으로 검사하는 방법이지만, 체외진단 시장 역시 계속해서 빠르게 성장을 하고 있습니다. 

 인체는 단백질, 지방, DNA와 RNA 등으로 구성되어 있습니다. 그 중 유전정보를 담고 있는 상자, DNA와 RNA로 질병을 확인하는 것을 ‘분자진단’이라고 합니다. 분자진단은 체외진단의 대표적인 진단 기술로 유전자 정보가 들어 있는 DNA 혹은 RNA에서 일어나는 분자 수준의 변화를 영상, 수치를 통하여 검출해 진단하는 기법입니다. 한마디로 말해 DNA와 같은 유전자를 이용한 정확한 질환 진단 검사법입니다. 질병 감염 여부 등을 판단할 목적으로 혈액, 소변, 타액 등 인체에서 유래하는 검체로부터 분자생물학적 기술을 이용하여 감염 물질(균, 바이러스)의 유전 정보를 담고 있는 유전자(DNA나 RNA)를 검사하며 소변검사나 혈액검사보다 정확도가 높고 조직검사를 하지 않아도 된다는 장점을 갖고 있습니다. 게다가 분자진단을 통해 주요 질병을 조기에 진단할 수 있게 되었습니다.
 분자진단시장이 성장하기 전엔 ‘면역진단법’을 많이 써왔습니다. 면역진단법은 앞서 말했던 자가 임신 진단기와 비슷한 원리(항원·항체반응)로, 질병에 의해 생성되는 항체 등 간접인자를 검사하는 것입니다. 테스트 당 비용이 낮고 간편하여 시장 규모는 크지만, 응용되는 분야가 감염성 질환에만 국한되고 질병을 조기에 진단하는 것이 어려워 민감도가 떨어지는 기술입니다. 하지만 분자진단법은 면역 진단법과는 다르게 질병의 조기 진단이 가능할 뿐만 아니라 응용분야가 감염성 질환을 더불어 암 진단, 맞춤의학으로도 이용될 수 있으며 질병원인인 DNA나 RNA를 직접 검사할 수 있어 조기진단과 높은 민감도로 정확합니다. 분자진단시장은 주로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 기반으로 하여 실행됩니다. PCR은 Polymerase Chain Reaction의 약자로서, 중합효소 연쇄반응이라 하며, 유전정보를 갖고 있는 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 기술입니다. 원리가 극히 단순하고, 쉽게 응용할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 식품과학, 환경과학, 고고학, 인류학에 이르는 분야까지도 그 활용범위가 넓습니다. 

출처 : http://www.yourgenome.org/facts/what-is-pcr-polymerase-chain-reaction

PCR 반응조건은 통상적으로 다음 세 가지 반응단계로 진행됩니다. DNA 변성 단계, Primer annealing 단계, 신장 단계입니다. PCR을 실행하기 위한 준비물들을 모두 준비한 다음, 다음과 같은 과정을 통해 특정 DNA나 RNA를 대량으로 증폭시킵니다.

출처 : http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/pcr.html

우선 DNA변성(Denaturation)단계에서는 두 가닥으로 꼬여있는 DNA를 94℃에서 15~30초간 처리하여 각각 한 가닥 DNA로 분리시킵니다. 이렇게 열처리에 의해 한 가닥으로 변성된 DNA와 설계한 primer를 공존 시킨 후 온도를 낮추면 2종류의 primer는 각각 상보적인 한 가닥 주형 DNA에 붙게 되는데 이 과정을 primer의 annealing 단계라 합니다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing 합니다. 마지막으로 분리된 DNA에 달라붙은 primer가 DNA polymerase 효소의 증폭 활성을 이용해 primer가 신장됩니다. 이 과정을 Extension, 즉 신장반응이라고 합니다. 신장반응에 필요한 시간은 DNA의 농도, 증폭 단편의 길이 등에 따라 다르지만 일반적으로 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서 30초~10분간 처리합니다.
  PCR을 통해 원하는 DNA영역을 사이에 둔 2종류의 primer를 이용, tube내에서 연속적인 효소반응으로 증폭시킨다면 DNA polymerase에 의한 주형 특이적인 DNA 합성을 반복하게 되고 목적하는 DNA 단편을 최종적으로 수십만 배 증폭시킬 수 있습니다. 따라서 PCR을 이용하여 분자진단검사를 하게 되면, DNA와 RNA 등의 핵산을 분석해 질병을 찾아낼 때 극소량의 시료로도 빠르게 결과 도출을 할 수 있게 됩니다. 

출처 : https://www.abmgood.com/marketing/knowledge_base/polymerase_chain_reaction_introduction.php


 분자진단은 PCR등을 이용하여 기존의 일반적인 진단방법보다 민감도가 뛰어날 뿐 아니라 감염병, 유전병, 암 진단은 물론 질병의 특성과 관련한 여러 정보를 제공할 수 있습니다. 즉 분자진단은 민감도, 특이성, 정확도가 우수하여 완벽한 재현성을 가진 방법으로 정량적인 결과를 산출함으로써 예후진단과 치료효과 분석에 좋은 platform으로 활용될 것입니다.

Posted by KIST PR

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