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  1. 2017.08.14 [취향저격 분자진단] 분자진단의 어벤져스! 4가지 기술을 소개합니다!(김미연 기자)

분자진단의 어벤져스! 4가지 기술을 소개합니다!

 

 세포 내에서 일어나는 다양한 분자 수준의 변화를 평가할 수 있는 분자진단 기법에는 수많은 기술들이 있다. 이번 기사에서는 분자진단시장을 지배하고 있는 대표적 기술 네 가지를 소개해 보고자 한다. 네 가지 기술은 마이크로 어레이(microarray), ②형광 동소 교잡법(fluorescent in situ hybridization), ③중합효소 연쇄 반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), ④차세대 염기 서열 분석(NGS, Next-Generation Sequencing)이다.

출처 : https://www.quora.com/What-is-the-central-dogma-of-molecular-biology-Is-it-true

 우선 이 기술들에 대해 설명하기 전에 DNA와 RNA 그리고 단백질이 어떤 과정을 거쳐 세포 내에서 생성되는지 간단한 이론 한 가지를 소개하고자 한다.  ‘Central Dogma' 이론은 왼쪽 그림과 같이 DNA가 RNA로 혹은 기능을 갖고 있는 생산물인 단백질로 바뀌는 분자생물학적 과정과 유전 정보의 흐름을 잘 설명해 주는데, 이 이론에 따르면 DNA가 갖고 있는 유전정보는 전사(transcription) 과정을 통해 RNA로 바뀐다. 이때 DNA의 유전정보가 단백질로 만들어지는 과정에서 조금의 손상이라도 일어나게 된다면 그 DNA는 재사용할 수 없기 때문에 중간에서 이 일을 잘 처리해줄 매개체가 필요하다. 이 매개체가 바로 RNA이다. RNA는 크기가 매우 작은 메신저로 세포 소기관인 리보솜이라 불리는 단백질 합성 공장에 들어가 DNA의 유전정보를 잘 해석하여(translation) 단백질을 만들어 낸다.

 

 첫 번째로 설명할 분자진단 기술은 “Microarray”이다. 이 기술은 대량으로 전사된 전사체의 발현 상황을 총체적으로 빠르게 분석할 수 있는 방법이다. 샘플을 준비해서 RNA를 추출하고 이 RNA에 역전사* 효소를 사용하여 cDNA**를 합성한다.
*전사가 DNA에서 RNA로 진행되어진 거라면 역전사는 유전정보가 RNA에서 DNA로 가는 것을 의미한다.
**cDNA : complementary DNA의 약자로, Reverse transcription(역전사)을 통해 mRNA로부터 합성되어진 분자
 DNA가 RNA보다 일반적으로 안정하므로 혼성화(hybridization)를 위한 단일 가닥(single strand)의 핵산을 RNA로부터 역전사 된 cDNA로 준비하여 마이크로 칩의 상보적인 염기서열과 혼성화시키는 원리를 기본으로 한다. Microarray slide 한 장에 고정시킬 수 있는 cDNA의 수가 수백 개에서 많게는 수 만개이므로 이 기술을 통해 수 만개 유전자의 발현 양상을 동시에 살펴볼 수 있다. cDNA가 합성되면 각각 다른 형광 염색(dye)을 통해 control과 sample을 표지하고 cDNA는 이중 나선 이기 때문에 이중 가닥을 단일 가닥으로 만들어주는 과정을 거쳐 칩에 있는 probe와 혼성화를 시켜주어 형광을 감지한다. Microarray 방법을 통해 샘플에서 추출해 낸 mRNA 수치가 항상 단백질의 양을 대변하는 것이 아니고, 정밀도가 떨어지기 때문에 반정량적인 기술이라는 한계점을 갖고 있다. 게다가 chip위에 존재하는 probe(탐칩)하고만 결합하기 때문에 chip 내에 일치하는 서열이 없다면 전사체의 전체적인 것을 알 수 없게 된다. 또한, hybridization*** 과정에서 교차혼성화(cross- hybridization)로 인한 noise가 발생할 수 있어 정확한 진단방법으로는 사용할 수 없다.
***형광물질을 염색체에 부착시키는 검사과정을 교잡반응(hybridization)이라 부른다.

출처 : http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/cdna-and-microarrays.html

 두 번째, 형광동소교잡법(fluorescent in situ hybridization)기술은 형광동소교합법, ‘FISH’로도 많이 불린다. 이 방법은 특정 DNA 염기서열의 존재유무를 규명하기 위하여 세포배양이나 DNA의 추출과정을 거치지 않고 염색체나 핵의 형태를 그대로 유지한 채 진행된다. 세포를 슬라이드에 도말하고 관찰하고자 하는 표적유전자의 특정 염기서열과 상보적인 DNA에 형광물질을 붙인 후 여러 종류의 탐침자(probe)****와 반응시켜 해당 표적유전자가 존재하는지, 존재한다면 그 위치를 확인함으로써 염색체나 유전자의 변이를 형광현미경으로 관찰하는 방법이다.
****무엇인가 원하는 것을 찾아내는 역할을 하는 매개체
실험 순서는 다음과 같다.

출처 : http://blog.daum.net/bioand/848

우선, 염색체 표본을 Slide Glass에 올려놓고 준비한 Probe DNA를 표본이 있는 Slide Glass에 실험에 필요한 시약들과 함께 첨가한다. 이중가닥 (Double Strand) DNA를 변성(Denaturation) 과정을 통해 단일가닥 DNA로 풀어줌으로서 교잡반응 과정을 준비한다. 교잡반응을 통해 단일가닥으로 변한 Probe DNA가 Sample DNA와 결합하게 되고 세정 과정을 통해 결합하지 않은 잔여 DNA를 제거한 뒤 형광을 확인한다. 따라서 종양임을 증명, 질환 분류, 종양의 재발 추적, 암유전자 위치연구, 기저 유전질환의 확인 등으로 응용할 수 있다. 대표적인 예로 혈액 종양 형광동소교잡법 검사는 혈액종양에서 수 백 개 이상의 세포 중 유전자 재배열을 가진 악성세포를 정확하게 정량 분석함으로서 추적 및 예후 판정에 도움을 준다. 형광동소교잡법이 정량적 분석뿐만 아니라 형태학적 관찰과 함께 검사 소요시간 단축, 간기 세포의 분석이 가능하다는 특징을 갖고 있으나, 검사시약이 고가이고, probe에 대한 결과만 알 수 있다는 한계가 있다.

 세 번째, PCR(polymerase chain reaction)은 내열성 DNA 중합효소를 이용하여, 특정 유전자를 분석 혹은 유전자 조작 가능한 수준으로 증폭하는 방법이다. 이 방법은 온도 순환(cycling)을 통하여, 증폭 부위 양 말단에 해당하는 염기서열을 가진 primer***** 쌍이 증폭 대상 DNA에 결합하고, 중합되고, 다시 떨어지는 과정을 반복하면서 특정 부위의 DNA를 기하급수적으로 합성해내는 과정을 말한다.
*****프라이머 : DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열(짧은 가닥의 RNA)로 DNA 복제과정에서 DNA합성에 이용됨

 

출처 :http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=jintaeky&logNo=220270279599

 마지막 차세대 염기서열 분석(NGS, Next-generation sequencing) 기술은 DNA 서열을 조각내어 빠르고 정확하게 읽어내는 방법으로 유전체 해독에 소요되는 비용과 시간을 획기적으로 줄여준다. 기본적으로 DNA 서열을 증폭해 형광 표식 등을 카메라로 찍고 이를 이미지 처리함으로써 염기를 읽어 낸다. 다음과 같이 NGS 샘플 준비 과정이 끝나면 데이터 분석을 하게 되는데 크게 ‘pre-processing’, ‘assembly’, ‘assembly를 이용한 이차 분석’으로 나누어진다. Pre- processing 단계에서는 다양한 플랫폼으로부터 서열화(sequencing)된 정보를 모으는 (assembly) 단계에 적용하기 위한 작업을 수행하고, 분석의 방향과 목적에 맞게 assembly를 수행한다. 이 후 assembly 결과를 이용한 variation 분석, binding site 분석, expression 분석 및 전체 정보에 대한 다양한 이차정보를 분석하게 된다.

출처 : https://www.abmgood.com/Next-Generation-Sequencing-Service.html

 Sanger sequencing을 1세대 Sequencing으로 하여 현재는 4세대까지 발전되었고, NGS는 다양한 응용분석이 가능하므로 염기서열 분석 외에도 유전자 발현분석, epigenetics 분석, metagenome분석 등이 가능해 다양한 연구목적에 효율적으로 적용되고 있다.  분자진단이 유전체 검사를 통해 질병 감염여부를 확인하는 등 조기진단을 통한 예방과 효율적인 치료에 큰 도움이 되는 분야인 만큼 다양한 기술들의 발전이 곧 분자진단시장의 새로운 시대를 열 것이라 생각한다.

Posted by KIST PR

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