PCR, 넌 어디까지 알고 있니?

 

PCR(polymer chain reaction)은 원하는 DNA의 sequence를 통해 다량의 DNA를 증폭하는 기술이다. Denaturation, Annealing, Extension의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 DNA template, primer, dNTP, polymerase등으로 구성되어 진행된다. 오늘은 유전자를 증폭시키는 PCR의 여러 가지 종류를 파헤쳐 보고자 한다.

 

1) RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.thermofisher.com

특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 뒤, PCR 증폭을 시행하는 기술이다. 실험 과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, 2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 노던 블롯 혼성화 분석(Northern blot hybridization)과 같은 방법을 사용하는 RNA 분석보다 실험방법이 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 복제(cloning) 할 수도 있다.

 

2) Allele-specific PCR
 DNA상에서 하나의 염기만 다른 SNP(single-nucleotide polymorphisms, 단일염기변이)를 분석하는 기술로서 서로 다른 allele의 DNA sequence만 안다면 primer를 제작하여 allele-specific PCR을 진행할 수 있다. Allele-specific PCR은 template과 SNP-specific primer사이에 불일치(mismatch)의 존재를 정확하게 판단하여 기존의 PCR에서의 비특이적인 증폭(amplification)을 막아 성공적으로 원하는 template만을 증폭 시킬 수 있다.

출처 : https://www.slideshare.net/

 

 

3) Asymmetric PCR
 Asymmetric PCR은 비대칭의, 불균형의 의미를 갖는 Asymmetric이란 단어에서 알 수 있듯이, 이중가닥의 DNA 중 한 가닥의 DNA만을 증폭시키는데 사용하는 기술이다. Single strand만을 얻을 목적으로 사용되며, Primer를 두 개 사용한다. 두 primer의 농도를 100:1로 섞어 PCR을 진행하는데, PCR 초기단계에서 한쪽의 primer는 소비되어 버리고 과잉의 primer에서 single strand DNA가 생성이 된다.

출처 : https://www.researchgate.net/

 

4) RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 

출처 : https://www.slideshare.net/

cDNA를 복제(cloning)하기 위해서는 cDNA library를 검사(screening)하는 방법이 가장 일반적이지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전체 cDNA를 얻어낼 수 있다. 반복 작업이 필요한 만큼 상당한 시간과 노력이 소모되는 작업이고, 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우엔 더욱 힘든 작업이 되어 버린다. 이 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 RACE(rapid amplification of cDNA ends) PCR 기술을 만들어 냈다. cDNA의 일부 염기서열만 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR 반응(reaction)을 통해 5'-end 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE PCR 방법에서는 모든 mRNA 3'-end에 존재하는 poly(A) tail(AAAAAAAA...AAAA-3')을 이용하여, 그와 상보된 oligo-(dT) primer(5'-TTTTTT...TTT-3')를 반응시켜 cDNA를 합성 시킬 수 있다.

 

5) IS-PCR(In Situ Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.slideshare.net/

 PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 민감성(sensitivity)과 ISH의 특정성(specificity)을 고루 갖추고 있다. IS-PCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, 슬라이드 글라스(slide glass) 등의 사용에 적합한 IS-PCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.  IS-PCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl(염화수소, 강산), proteinase K(단백질분해효소) 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 적절한 선택과 사용이 중요하다. 아직까지는 IS-PCR 방법의 효율이 기대효과 대비 그다지 높지 못하지만, 민감성과 특정성이 높아야 되는 진단 및 분석 분야에서는 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 

 

6) Hot start PCR
 Taq1 polymerase 효소는 37℃에서도 효소 활성이 좋기 때문에 간혹 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가 DNA 분자에 붙어 증폭(extension)되는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 결합(annealing)이 일어날 경우 primer의 불일치 접합 확률이 높고, 결과적으로 정확도가 떨어지는 결과를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot-start PCR기술이다. Hot-start PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에야 PCR이 진행되게 필요한 물질(ex. polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. 그러면 primer가 불일치하는 DNA 분자와 붙는 상황을 피할 수 있어 상대적으로 명확한 결과를 얻을 수 있다.

출처 :https://us.bioneer.com/

 

7) RAPD PCR 

출처 : https://www.researchgate.net/

 RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다. PCR을 진행할 때 primer가 짧을 경우 게놈(genome)상의 이곳저곳에 달라붙어 여러 조각(fragment)을 생성하게 되고, 전기영동을 사용하면 생명체마다 각각의 독특한 band를 형성하게 되는데, 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이며, 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이가 나타날 것이다. 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬워 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 확인하기 위해 사용된다.

 

8) Real time qPCR(quantitative PCR)
 PCR 산물의 양을 실시간으로 측정하기 위해 사용되는 기술이다. DNA, RNA, cDNA의 양을 정량적으로 분석할 수 있고, 한 샘플에서 PCR 산물의 copy 수를 측정할 수 있다. RT-qPCR 방법에서는 형광염색법(dye)을 사용하는데, SYBR-green, Evagreen 혹은 DNA probe를 가진 형광, Taqman을 이용해 실시간으로 증폭되는 산물의 양을 정량적으로 측정한다.

 

9) Nest PCR 
 Nest PCR은 한 번 PCR로 증폭한 DNA 단편을 한 번 더 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 방법이다. 두 개의 서로 다른 primer set를 이용하여 연속적으로 두 번의 PCR을 진행하게 되면 비특이적 반응을 감소시킬 수 있어 정확하고, PCR을 2회 실시하므로 감도가 상승하는 효과를 얻을 수 있다.

출처 : https://en.wikipedia.org/wiki/Nested_polymerase_chain_reaction

10) Multiplex PCR

출처 : https://www.labce.com/pcr_fundamentals.aspx

한 번의 PCR로 서로 다른 여러 개의 DNA들을 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. 반응시킬 용액에 서로 다른 DNA를 증폭시킬 primer를 첨가해 target sequence에 붙을 수 있도록 PCR 조건을 잡아주면 한 번에 증폭되어 상당한 시간과 노력을 절약할 수 있다. 그러나 한 번에 여러 가지 target을 증폭시키기 때문에 각 primer set들의 annealing 온도를 비슷한 범위에서 최적화 시켜야 되는 전처리 작업이 필요하다. Multiplex PCR은 병원균 확인, SNP genotyping, 돌연변이 분석, template의 양, RNA를 detection 하는데 유용하다.

 

11) Inverse PCR 
 Inverse PCR은 이미 서열을 알고 있는 DNA의 양 옆에 서열을 알지 못하는 부분을 알고자 할 때 많이 이용된다. 예를 들어 5’-xxxxxxx=========xxxxxx-3’ (x서열을 모름, =서열을 알고 있음)
이런 염기 서열에서 x 부분을 알고자 할 때 사용되는데, 제일 먼저 제한 효소로 자르고, 자른 부위를 원으로 만든다. 그리고 그 원으로 된 곳에primer를 붙이는데, 이 때 연장(elongation)과 같은 방향으로 가도록 primer를 붙인다. Inverse라는 말은 primer가 기존의 PCR과는 다른 방향으로 간다고 해서 붙여졌다.

출처 : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/da/Inverse_PCR_2.png

이 외에도 더 많은 PCR 종류들이 산업, 의학, 과학, 농업 등 다양한 분야에서 사용되어지고 있으며, 더 효율적인 PCR 기술들이 현재도 개발되고 있다. PCR은 분자생물학의 표준 실험법으로 특정한 유전자를 증폭하여 유전형을 알아보는 것부터, 신종플루, HIV, 지카바이러스, 콜레라균 등 온갖 병원균을 검출하고 종류를 확인할 때, 변사체의 신원을 분석할 때, 네안데르탈인의 뼈에서 추출한 DNA로부터 현생인류와의 관련성을 찾아 볼 때 등 굉장히 다양한 분야에서 적용되고 있다. 전 세계 PCR 시장의 규모와 PCR 기반 기술로 작동하는 차세대 시퀀싱 시장들이 200억 달러 이상의 규모가 될 것이라는 예상처럼, PCR은 현대문명을 구성하는 하나의 핵심적인 기술인 것이다.

Posted by KIST PR

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