DNA 나노스위치 개발로 물리적 개폐를 통해 단백질의 활성 조절
세포 활성 및 정교한 조작이 가능, 신개념 세포치료제 개발 기대

 

세포는 외부의 물리, 화학적 신호를 인식하여 그에 따른 신호 단백질의 활성을 끊임없이 가역*(可逆, reversible)적으로 조절하면서 항상성을 유지한다. 예를 들어, 세포 주기(cell cycle)에 관여하는 단백질이 활성화 되면 세포가 분열이 시작되고, 분열이 끝난 후엔 단백질의 활성이 억제되는데, 이러한 가역반응에 문제가 생겨 세포가 끊임없이 분열되면 암을 유발하게 된다.
*가역 : 화학반응에서 반응 조건에 따라 정반응과 역반응이 모두 일어날 수 있는 반응

[그림 1] pH 에 감응하는 DNA 나노 케이지를 이용한 단백질의 활성 조절 모식도.
DNA 나노케이지 안쪽으로 단백질이 위치하도록 DNA 염기 가닥에 직접 공유 결합시켰다. DNA 나노케이지 정사면체의 한쪽 변을 pH에 민감한 염기서열로 구성하여, DNA 나노 케이지가 pH에 따라 개폐될 수 있게 설계함으로써, 단백질과 주변의 다른 단백질(항체)의 접근성 및 활성을 pH에 의해 가역적으로 조절할 수 있게 하였다.  

 

이렇듯 단백질의 활성을 인위적, 가역적으로 조절하면 세포 내에서 일어나는 대부분의 생명현상을 원하는 대로 조절할 수 있는데, 기존에 쓰이던 가장 대표적인 방법은 외부의 물리, 화학적 자극(pH, 온도, 빛 등)에 반응할 수 있는 반응기를 원하는 단백질 내부에 삽입하는 것이나, 해당 단백질의 구조와 기능을 면밀히 파악하고 있어야만 가능하다는 한계가 있다.

한국과학기술연구원(KIST, 원장 이병권) 의공학연구소 테라그노시스연구단 김소연 박사팀은 조절하고자 하는 단백질의 구조 및 기능과 무관하게 범용적으로 사용될 수 있는 나노스위치를 개발했다. 연구진은 생체 내 DNA 나노구조체를 케이지(cage)로 이용하고, 단백질의 활성을 인위적, 가역적, 반복적으로 조절하는데 성공했다고 밝혔다.

[그림 2] DNA 나노케이지의 pH 감응성 측정.
(A) pH가 낮아져 용액이 산성을 띄게 되면 DNA 나노케이지 정사면체의 한 변을 구성하는 DNA 염기 서열 특성에 i-motif 구조가 생기면서 변이 풀리게 된다.
(B) pH에 따라 DNA 나노케이지의 한쪽 변이 개폐됨을 확인하기 위해, DNA 나노케이지의 양 꼭지점에 해당하는 위치에 두 개의 형광 염료를 표지하고, 두 형광 염료의 거리를 형광 공명 에너지 전달 현상 (FRET)으로 측정하였다. pH가 낮아져 용액이 산성을 띄게 되면 i-motif 구조가 생기면서 두 형광 염료의 거리가 짧아지고, 형광 공명 에너지 전달 현상이 극대화됨을 보여준다.

 

[그림 3] DNA 나노케이지를 이용한 단백질의 접근성 조절.
(A) DNA 나노케이지 밖의 항체가 DNA 나노케이지에 갇혀있는 단백질 (RNase A, RA)과 반응할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 단분자 풀다운 방법의 모식도. 유리 표면에 부착된 RA 특이적 항체에 의해 풀다운 된 단백질의 개수를 세기 위하여, RA 혹은 DNA 나노 케이지에 Cy3 형광 염료를 표지하였다.
(B) 하얀색으로 형광을 나타내는 점들이 유리표면에 있는 항체에 의해 포획된 단백질을 나타낸다. DNA 나노케이지 안에 단백질이 위치하는 경우 (Td-IN-RA)에 용액의 pH가 높아져 산성에서 염기성으로 바뀌게 되면 DNA 케이지 안에 존재하는 단백질이 갇히게 되면서 유리판 표면위의 항체에 의해 포획되지 않으나, pH가 다시 산성으로 바뀌게 되면 DNA 케이지가 열리게 되면서 유리표면의 항체에 의해 포획됨을 나타낸다.

 

KIST 김소연 박사팀은 원하는 단백질이 정사면체 모양의 DNA 나노케이지(DNA nano cage) 안쪽에 위치하도록 DNA 염기서열을 구성하였고, 정사면체의 한 변이 외부 자극의 일종인 산도(pH) 변화에 의해 가역적으로 개폐될 수 있도록 설계함으로써, pH 변화에 따른 단백질의 외부 접근성을 조절하였다. 기존의 방법은 주로 나노 입자를 케이지로 이용하여 단백질을 가두어 두었다가 특정 신호에 의해 단백질을 물리적으로 방출하는 방식이여서, 방출된 단백질을 다시 가두는 역반응을 유도하기 어려웠다. 즉, 가역 반응을 모사할 수 없어 반복적으로 활성을 조절하는 것이 쉽지 않았다. 그러나, 이번 연구진이 개발한 나노스위치의 경우 단백질을 나노케이지 내부에 고정시킴으로써 나노케이지의 개폐를 통해 단백질의 활성을 가역적으로 조절할 수 있었다. 연구진은 개발한 DNA 나노케이지에 단백질(RNase A*)을 가두어 놓은 경우, 외부 용액에 있는 다른 단백질과의 접근성 및 RNase A 단백질의 활성이 모두 억제되었으나, 산도(pH)를 바꾸어 나노케이지를 열게 되면 억제되었던 접근성 및 단백질의 활성이 모두 증가되는 것을 확인하였다. 특히 pH를 연속적으로 바꾸어 가며 단백질의 활성을 측정한 결과, 반복적인 활성 조절이 가능함을 밝혀냈다.  
**RNAse A : RNA를 분해하는 효소 단백질, pH(4.0-9.0)와 온도(4-70 ℃)의 변화와 무관하게 활성을 유지하는 특성을 지님. 주로 암세포 내 RNA를 분해함으로써 암세포를 제거하는 용도로 사용

[그림 4] DNA 나노케이지를 이용한 단백질 활성 조절 및 가역성 확인.
(A) DNA 나노케이지 안에 단백질이 위치하는 경우, pH를 높여 나노케이지를 닫게 되면 (초록색 별 그래프) 단백질의 활성이 저해됨을 확인하였다. (B) 단백질의 활성을 여러번에 걸처 가역적으로 조절 가능한지 확인하기 위해 pH를 연속적으로 바꿔가면서 DNA 나노케이지 안에 있는 단백질의 활성을 측정하였다. 연속적으로 pH를 3번 이상 변화시켜도 단백질의 활성이 가역적으로 조절될 수 있음을 확인하였다.

 

KIST 김소연 박사는 “본 연구로 개발된 DNA 나노스위치를 단분자 수준에서 작동하면, 기존에 알려지지 않은 단백질의 생물리학적 특성을 규명하는 연구에도 적용될 수 있다.”고 말하며, “개발된 DNA 나노케이지는 세포 내 전달체로도 사용이 가능하여, 세포의 움직임, 주기(cell cycle), 나아가 줄기 세포의 타입(운명)까지도 정교하게 조작하는 방법으로 응용이 가능하여 향후 신개념 세포 치료제 개발에 도움을 줄 것으로 기대한다.”고 밝혔다. 

 

본 연구는 과학기술정보통신부(장관 유영민) 지원으로 KIST 기관고유사업과 한국연구재단 이공분야 기초연구사업 등의 지원을 받아 수행되었으며, 연구결과는 미국 화학회에서 발행되는 나노 분야의 국제학술지인  ‘ACS Nano’(IF = 13.942)에  8월 28일(월) 온라인 게재되었다.

 

 * (논문명) Reversible Regulation of Enzyme Activity by pH-Responsive Encapsulation in DNA Nanocages
   - (제1저자)  김성호 학생 (통합과정),  UST KIST 스쿨 바이오-메디컬 융합 전공,
   - (교신저자) 한국과학기술연구원 김소연 박사

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[MBC] 뉴스 "KIST, 알츠하이머병 치료 신약물질 개발 "

 

KIST의 김영수 양승훈 박사님의 알츠하이머 치료 신약 개발과 관련된 내용이 방송에 나왔습니다. 알츠하이머병의 주요 원인인 베타아밀로이드, 타우 단백질을 동시 조절할 수 있는 신약(Nec-1) 개발에 관련된 내용인데요 뇌 세포의 사멸을 막고, 정상인의 수준으로 회복가능한 것을 실험 통해 증명하였습니다. 정말 궁금하시죠? 링크된 방송에서 확인해 보세요

 

[방송보기]

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치매치료 신약물질 개발, 30대 과학자의 집념

 

알츠하이머는 노령화가 급속히 진행되는 현대사회 구성원들에게 정말 무서운 질병입니다. 특히다 별다른 치료 방법이 없다는 점이 더 큰 위협으로 다가오는데요. 치매연구 외길인생 36년을 걸오오신 박사님이 있어 소개해드리려고 합니다. 바로 KIST 치매DTC융합연구단의 양승훈 박사님이십니다. 아시아경제에서 양박사님을 취재하였는데요 어떤 분인지 궁금하시죠?

 

 

 

[아시아경제 기사보기]

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 - 주요 발병기전인 베타아밀로이드(Aβ), 타우(tau) 단백질을 동시에 표적억제
 - ‘Necrostatin-1’신약물질 생쥐 투여 후 인지기능 정상 수준으로 회복
 - 치매DTC 융합연구단 및 대통령 Post-Doc 펠로우십 사업 수행 성과

 

알츠하이머병(알츠하이머성 치매)은 현대인의 10대 사망 원인 질환 중 유일하게 예방 및 치료 방법이 없는 질병으로 치매의 60~80%를 차지하는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환이다. 현재까지 알려진 알츠하이머병의 주요 특징은 뇌 속에 존재하는 베타아밀로이드와 타우 단백질 이상 현상으로, 이들을 각각 표적하는 약물이 개발된 바 있으나 연이은 임상실패로 인해 학계와 산업계 전문가들은 베타아밀로이드와 타우, 두 개의 학파로 나뉘어 어떤 단백질을 조절해야 알츠하이머 치료가 가능한지 20년 넘게 치열한 논쟁을 벌이고 있었다.

 

 

한국과학기술연구원(KIST, 원장 이병권) 치매DTC융합연구단 김영수, 양승훈 박사팀은 베타아밀로이드와 타우 단백질의 이상 현상을 동반 억제하는 신약 후보물질인 Necrostatin-1(네크로스타틴-원)을 개발했다. 이 합성신약은 동시에 두 단백질을 직접 뇌에서 조절하고, 치매 증상을 정상 수준으로 회복시켜줄 수 있는 물질로, 국제적으로 처음 보고되는 치료방법이다. 알츠하이머병은 환자의 뇌에서 베타아밀로이드의 집적으로 인해 나타나는 신경반과 타우단백질의 과다인산화/집적으로 인해 나타나는 신경섬유다발의 형성이 주요 특징으로 관찰되고 있다.

KIST 김영수 박사, 양승훈 박사팀은 Necrostatin-1(네크로스타틴-원)이라는 신약 후보물질을 알츠하이머 생쥐에 투약하였을 때, 베타아밀로이드 단백질의 응집체가 뇌에서 현저하게 감소되며, 타우 단백질의 과다인산화 및 응집현상 역시 억제된다는 기능을 밝혀내었다. 알츠하이머병 주요 원인 단백질을 모두 표적 억제하기 때문에, 뇌세포 사멸을 억제시키고 인지기능이 개선되는 효능을 나타내었다.  연구진은 알츠하이머병 환자의 뇌세포가 점점 죽어가면서 뇌의 크기가 작아지고 인지능력도 줄어든다는 사실에 집중해 뇌세포자연사와 괴사를 모두 억제할 수 있는 약물(Necrostatin-1)을 연구 중이었다. 연구 중 Necrostatin-1 (네크로스타틴-원)이 베타아밀로이드 응집현상을 조절하며, 뿐만 아니라 타우단백질의 과다인산화 및 응집을 억제한다는 사실을 밝혀냈다. 연구진은 이 결과를 바탕으로 네크로스타틴-1을 알츠하이머병에 걸린 생쥐에게 3개월간 투여한 후 뇌기능의 변화를 관찰했고, 인지 능력을 관장하는 뇌의 해마와 대뇌피질 부위에 있는 베타아밀로이드 응집체 및 타우단백질 과다인산화가 모두 제거된 것을 발견했다. 생쥐의 기억력 검사인 행동시험(Y-maze, Passive avoidance)에서 약물이 투여된 알츠하이머 생쥐의 인지 기능이 정상 수준으로 회복된 것을 알 수 있었으며, 또한, 알츠하이머병이 진행되면 나타나는 뇌 신경세포의 사멸 및 뇌 구조의 파괴 등의 증상 역시 사라짐을 확인했다.

 

이번 연구결과는 베타아밀로이드 및 타우를 각각 별개로 억제시키는데 초점을 맞춘 기존의 치료제 개발방법과 차별된다. 개발된 네크로스타틴-1은 병의 증상과 함께 나타나는 뇌신경세포사멸 기전 조절을 통한 새로운 치료방법이며, 베타아밀로이드와 타우 단백질을 동시에 조절할 수 있는 획기적인 신약후보물질이다. 김영수 박사는 “이번 연구 성과는 국제적으로 오랜 논쟁의 대상인 ‘아밀로이드 vs 타우’ 가설의 종지부를 찍을 수 있는 새로운 치료전략을 제시했다는 것에 의미가 크다.”며, “본 연구의 결과를 토대로 알츠하이머병의 병리학적 원인 규명 및 근원적 치료제 개발 연구에 더욱 힘쓸 예정”이라고 말했다. 또한, 양승훈 박사는 “세포자연사(apoptosis)와 괴사(necrosis)가 합쳐진 개념인 네크롭토시스(necroptosis)가 뇌질환에 미치는 영향을 광범위하게 연구 중이다”라고 밝혔다. 연구진은 이번에 개발된 신약물질을 의약품으로 허가될 수 있도록 전임상 및 임상 연구를 추진하고 있으며, 또한 알츠하이머병의 혈액 진단 시스템 개발 사업과 연계되어 알츠하이머병의 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있는 연구도 진행 중이다.

 

본 연구는 국가과학기술연구회(NST, 이사장 이상천) 치매DTC융합연구단(단장:배애님 박사/KIST) 및 교육부(장관 이준식, 전담기관:한국연구재단) 대통령 Post-Doc 펠로우십 지원을 통해 수행되었다. 본 연구 결과는 세계적으로 권위있는 과학지인 ‘EMBO Molecular Medicine’(IF:9.5, JCR:5.6%)에 11월 17일자로 온라인 게재되었다.

* (논문명) ‘Nec-1 alleviates cognitive impairment with reduction of Aß and tau abnormalities in APP/PS1 mice’
      - (제 1저자) 한국과학기술연구원 양승훈 박사                   
      - (교신저자) 한국과학기술연구원 김영수 박사

 

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- 반도체 공정을 이용한 그래핀 미세 패턴의 대면적 구현
- 피 한방울에 존재하는 극미량의 단백질 검출 가능
- 혈액 검진만으로 치매 조기진단 및 다양한 질병 진단이 가능
 
   최근 국내 연구진이 ‘꿈의 물질’이라 불리는 그래핀을 대면적 패널(4인치 웨이퍼)로 구현하여, 다양한 질병 및 질환들을 진단할 수 있는 고감도 바이오센서 제작기술을 개발했다.
 
   한국과학기술연구원(KIST, 원장 이병권) 바이오마이크로시스템연구단 황교선 박사팀은 반도체 공정기술을 적용하여 수십 마이크로미터(10만~100만 분의 1 미터)의 패턴을 정교하게 구현한 그래핀 바이오센서를 제작하였다. 이 센서는 혈액 검진을 통해 피 한방울에 들어있는 특정 단백질의 양을 파악함으로써 질병 발현 유무를 알 수 있다. 특히, 그래핀 센서는 감도가 매우 우수하여 혈액 내 극미량(피코그램(pg/mL)*1조분의 1그램)의 바이오마커(질병표지 단백질)를 빠르고 정확하게 검출해 내어 다양한 질병의 체액 진단이 가능하다.

   개발된 센서 기술의 상용화를 위해서는 민감도와 재현성 등의 센서 성능이 우수해야할 뿐만 아니라 대면적에서 센서를 구현하여 제작 단가를 낮추는 제작법이 매우 중요하다. 그러한 측면에서 본 그래핀 바이오 센서 제작 기술은 대면적 구현 가능성을 확보한 상용화 후보 기술이라고 할 수 있다. 그래핀 바이오센서는 혈액 내 존재하는 극미량의 베타아밀로이드 단백질을 검출하여 대표적 노화 질환인 알츠하이머 치매를 쉽고 빠르게 진단가능할 것으로 보인다. 유전자 변이 쥐 (Transgenic (TG) mouse)와 정상 쥐 (Wild Type (WT) mouse)의 혈액을 이용하여 치매 혈액 진단 가능성을 확인하였고, 현재 연구진은 정상인과 환자를 구분 할 수 있는 임상 시험 자료를 확보한 상태다.

  

 본 연구는 대표적인 융합연구의 형태로 이루어졌으며 KIST 김영수 박사 연구팀과 유전자 변이 쥐 관련 연구를 공동 수행하였고, 중앙대학교 장석태 교수팀과 그래핀 센서 제작 기초 성능 평가 연구를 공동 수행하였다. 올해 초 개발된 치매혈액진단시스템을 기업에 기술 이전한 경험이 있는 황교선 박사팀은 치매 뿐만 아니라 암, 당뇨, 우울증 등 다양한 질환을 조기에 진단할 수 있는 가능성을 평가하여 상용화에 이를 수 있도록 후속연구에 박차를 가하고 있다.

   KIST 황교선 박사는 “본 연구 결과로 혈액 검사라는 쉬운 방법을 통해 다양한 질병이 진단 가능한 고감도 센서의 상용화에 한발 더 접근했고, 대면적에 구현할 수 있는 기술적 토대를 마련했다는 데 의미가 있다”며, “다양한 질병의 적용 가능성을 확인하기 위하여 국내외 임상 기관과 협력하여 임상 연구를 수행할 예정이다.”고 밝혔다. 향후 이 기술이 상용화 되면 누구나 편리하게 혈액검진으로 각종 난치병을 포함한 질병을 진단 가능할 것으로 기대된다.

   본 연구는 KIST 기관고유 미래원천기술개발사업과 개방형 연구사업(ORP)과 보건복지부가 시행하는 질환극복기술개발사업의 지원을 받아 수행되었으며, 연구 결과는 세계적인 우수 과학 저널인 ‘Scientific Reports’에 8월 10일자 온라인 판에 게재되었다.
 
 * (논문명) Wafer-scale high-resolution patterning of reduced graphene oxide films for
                detection of low concentration biomarkers in plasma

      - (제 1저자) 한국과학기술연구원 김진식 박사
      - (교신저자) 한국과학기술연구원 황교선 박사

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