PCR, 넌 어디까지 알고 있니?

 

PCR(polymer chain reaction)은 원하는 DNA의 sequence를 통해 다량의 DNA를 증폭하는 기술이다. Denaturation, Annealing, Extension의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 DNA template, primer, dNTP, polymerase등으로 구성되어 진행된다. 오늘은 유전자를 증폭시키는 PCR의 여러 가지 종류를 파헤쳐 보고자 한다.

 

1) RT-PCR(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.thermofisher.com

특정 부위의 RNA를 template로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)를 합성한 뒤, PCR 증폭을 시행하는 기술이다. 실험 과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나뉘어지며, 2) 과정은 genomic DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 노던 블롯 혼성화 분석(Northern blot hybridization)과 같은 방법을 사용하는 RNA 분석보다 실험방법이 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다. 염기서열이 알려진 유전자의 경우 RT-PCR을 통해서 전체 길이의 cDNA를 간단하게 합성하여 복제(cloning) 할 수도 있다.

 

2) Allele-specific PCR
 DNA상에서 하나의 염기만 다른 SNP(single-nucleotide polymorphisms, 단일염기변이)를 분석하는 기술로서 서로 다른 allele의 DNA sequence만 안다면 primer를 제작하여 allele-specific PCR을 진행할 수 있다. Allele-specific PCR은 template과 SNP-specific primer사이에 불일치(mismatch)의 존재를 정확하게 판단하여 기존의 PCR에서의 비특이적인 증폭(amplification)을 막아 성공적으로 원하는 template만을 증폭 시킬 수 있다.

출처 : https://www.slideshare.net/

 

 

3) Asymmetric PCR
 Asymmetric PCR은 비대칭의, 불균형의 의미를 갖는 Asymmetric이란 단어에서 알 수 있듯이, 이중가닥의 DNA 중 한 가닥의 DNA만을 증폭시키는데 사용하는 기술이다. Single strand만을 얻을 목적으로 사용되며, Primer를 두 개 사용한다. 두 primer의 농도를 100:1로 섞어 PCR을 진행하는데, PCR 초기단계에서 한쪽의 primer는 소비되어 버리고 과잉의 primer에서 single strand DNA가 생성이 된다.

출처 : https://www.researchgate.net/

 

4) RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) 

출처 : https://www.slideshare.net/

cDNA를 복제(cloning)하기 위해서는 cDNA library를 검사(screening)하는 방법이 가장 일반적이지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전체 cDNA를 얻어낼 수 있다. 반복 작업이 필요한 만큼 상당한 시간과 노력이 소모되는 작업이고, 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우엔 더욱 힘든 작업이 되어 버린다. 이 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 RACE(rapid amplification of cDNA ends) PCR 기술을 만들어 냈다. cDNA의 일부 염기서열만 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR 반응(reaction)을 통해 5'-end 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE PCR 방법에서는 모든 mRNA 3'-end에 존재하는 poly(A) tail(AAAAAAAA...AAAA-3')을 이용하여, 그와 상보된 oligo-(dT) primer(5'-TTTTTT...TTT-3')를 반응시켜 cDNA를 합성 시킬 수 있다.

 

5) IS-PCR(In Situ Polymerase Chain Reaction) 

출처 : https://www.slideshare.net/

 PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 민감성(sensitivity)과 ISH의 특정성(specificity)을 고루 갖추고 있다. IS-PCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, 슬라이드 글라스(slide glass) 등의 사용에 적합한 IS-PCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.  IS-PCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl(염화수소, 강산), proteinase K(단백질분해효소) 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 적절한 선택과 사용이 중요하다. 아직까지는 IS-PCR 방법의 효율이 기대효과 대비 그다지 높지 못하지만, 민감성과 특정성이 높아야 되는 진단 및 분석 분야에서는 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 

 

6) Hot start PCR
 Taq1 polymerase 효소는 37℃에서도 효소 활성이 좋기 때문에 간혹 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가 DNA 분자에 붙어 증폭(extension)되는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 결합(annealing)이 일어날 경우 primer의 불일치 접합 확률이 높고, 결과적으로 정확도가 떨어지는 결과를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot-start PCR기술이다. Hot-start PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에야 PCR이 진행되게 필요한 물질(ex. polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. 그러면 primer가 불일치하는 DNA 분자와 붙는 상황을 피할 수 있어 상대적으로 명확한 결과를 얻을 수 있다.

출처 :https://us.bioneer.com/

 

7) RAPD PCR 

출처 : https://www.researchgate.net/

 RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다. PCR을 진행할 때 primer가 짧을 경우 게놈(genome)상의 이곳저곳에 달라붙어 여러 조각(fragment)을 생성하게 되고, 전기영동을 사용하면 생명체마다 각각의 독특한 band를 형성하게 되는데, 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이며, 그렇지 않을 경우에는 서로 많은 차이가 나타날 것이다. 이 RAPD PCR은 방법이 비교적 간단하고 쉬워 genome sequencing을 하기 전에 대략적인 종간의 관계를 확인하기 위해 사용된다.

 

8) Real time qPCR(quantitative PCR)
 PCR 산물의 양을 실시간으로 측정하기 위해 사용되는 기술이다. DNA, RNA, cDNA의 양을 정량적으로 분석할 수 있고, 한 샘플에서 PCR 산물의 copy 수를 측정할 수 있다. RT-qPCR 방법에서는 형광염색법(dye)을 사용하는데, SYBR-green, Evagreen 혹은 DNA probe를 가진 형광, Taqman을 이용해 실시간으로 증폭되는 산물의 양을 정량적으로 측정한다.

 

9) Nest PCR 
 Nest PCR은 한 번 PCR로 증폭한 DNA 단편을 한 번 더 내부의 primer를 사용하여 증폭하는 방법이다. 두 개의 서로 다른 primer set를 이용하여 연속적으로 두 번의 PCR을 진행하게 되면 비특이적 반응을 감소시킬 수 있어 정확하고, PCR을 2회 실시하므로 감도가 상승하는 효과를 얻을 수 있다.

출처 : https://en.wikipedia.org/wiki/Nested_polymerase_chain_reaction

10) Multiplex PCR

출처 : https://www.labce.com/pcr_fundamentals.aspx

한 번의 PCR로 서로 다른 여러 개의 DNA들을 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. 반응시킬 용액에 서로 다른 DNA를 증폭시킬 primer를 첨가해 target sequence에 붙을 수 있도록 PCR 조건을 잡아주면 한 번에 증폭되어 상당한 시간과 노력을 절약할 수 있다. 그러나 한 번에 여러 가지 target을 증폭시키기 때문에 각 primer set들의 annealing 온도를 비슷한 범위에서 최적화 시켜야 되는 전처리 작업이 필요하다. Multiplex PCR은 병원균 확인, SNP genotyping, 돌연변이 분석, template의 양, RNA를 detection 하는데 유용하다.

 

11) Inverse PCR 
 Inverse PCR은 이미 서열을 알고 있는 DNA의 양 옆에 서열을 알지 못하는 부분을 알고자 할 때 많이 이용된다. 예를 들어 5’-xxxxxxx=========xxxxxx-3’ (x서열을 모름, =서열을 알고 있음)
이런 염기 서열에서 x 부분을 알고자 할 때 사용되는데, 제일 먼저 제한 효소로 자르고, 자른 부위를 원으로 만든다. 그리고 그 원으로 된 곳에primer를 붙이는데, 이 때 연장(elongation)과 같은 방향으로 가도록 primer를 붙인다. Inverse라는 말은 primer가 기존의 PCR과는 다른 방향으로 간다고 해서 붙여졌다.

출처 : https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/d/da/Inverse_PCR_2.png

이 외에도 더 많은 PCR 종류들이 산업, 의학, 과학, 농업 등 다양한 분야에서 사용되어지고 있으며, 더 효율적인 PCR 기술들이 현재도 개발되고 있다. PCR은 분자생물학의 표준 실험법으로 특정한 유전자를 증폭하여 유전형을 알아보는 것부터, 신종플루, HIV, 지카바이러스, 콜레라균 등 온갖 병원균을 검출하고 종류를 확인할 때, 변사체의 신원을 분석할 때, 네안데르탈인의 뼈에서 추출한 DNA로부터 현생인류와의 관련성을 찾아 볼 때 등 굉장히 다양한 분야에서 적용되고 있다. 전 세계 PCR 시장의 규모와 PCR 기반 기술로 작동하는 차세대 시퀀싱 시장들이 200억 달러 이상의 규모가 될 것이라는 예상처럼, PCR은 현대문명을 구성하는 하나의 핵심적인 기술인 것이다.

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NGS를 응용한 sequencing 방법

 

 NGS(Next-generation sequencing)의 비약적인 발전으로 레퍼런스 염기서열이 없이 분석이 가능한 de novo sequencing, 유전자 발현 변화를 볼 수 있는 transcriptome profiling, 코딩 영역만 해독하는 엑솜시퀀싱 및 질병의 진행 여부 연구까지 NGS가 있어 가능해졌다. 이번 기사에서는 NGS를 응용한 sequencing 방법들에 대해 이야기해보고자 한다.

(1) Resequencing
 Resequencing은 이미 레퍼런스 유전체가 완성된 생물종의 다양한 유전체를 분석하고 그 서열을 레퍼런스와 비교함으로써 특정 유전체 내 SNP 등의 변이를 발굴하고자 할 때 주로 쓰인다. NGS가 가장 널리 활용되고 있는 분야이며 엑솜 시퀀싱, 유전자를 이용한 진단 검사 의학, Genome-wide association studies(전장유전체연관분석연구, GWAS) 등으로 응용된다.
☞ 여기서 잠깐, SNP란?
단일염기 다형성 [single nucleotide polymorphism, SNP]으로 불리며, 염색체의 단일부위에서 여러 가지 DNA 염기들 중의 하나에 나타나는 일반적인 돌연변이이다. 약 500 ~1,000염기 당 1개꼴로 나타나며 이에 의하여 개인의 유전적 다양성이 발생한다.

(2) Whole exome sequencing (WES)
 RNA 서열 상 단백질을 만들어내는 총 영역, 엑솜(Exome)은 전체 인간 유전체의 2% 정도 밖에 차지하지 않지만, 현재까지 알려진 질병 관련 유전자들의 85% 가량이 엑솜에 위치해 있다. 따라서 질병 관련 유전자 발굴 및 진단 검사에는 빠르고 효율적이면서 저비용의 분석이 가능한 엑솜 시퀀싱을 주로 활용한다. 전체 서열에서 엑솜만을 시퀀싱하기 위해서는 엑솜에만 해당하는 probe를 샘플에 섞어주는 solution-based capture나 probe를 칩에 붙여서 추출해내는 array-based capture법, PCR을 이용한 방법 등이 있다. 그러나 라이브러리 제작 단계에서 엑솜 내 G염기와 C염기의 함량의 차이 등으로 인하여 capture probe와 DNA 조각 간의 결합력의 차이가 발생하는 등 라이브러리의 편중화가 일어날 가능성이 많다는 한계점이 있다.

(3) 분자진단검사, 임상의학
 기존의 ‘생어 시퀀싱법’은 분석 시간 및 비용의 문제로 특정 질환에 특이적인 소수의 유전자 검사만이 수행되었고 정확도가 낮았다. 그러나 NGS의 발전으로 인하여 하나의 샘플에서 다양한 질병 관련 유전자들을 동시에 분석할 수 있게 되었다. 이러한 assay들이 다양하게 개발되고 진단 장비로 승인을 받게 되면서 맞춤 의학 (companion diagnostics)시장까지  큰 영향력을 펼치게 될 것으로 기대된다.
 NGS는 임상 의학에서도 다양하게 활용될 수 있다. 한 예로 장기 이식 환자의 혈액에서 장기 제공자의 유전체와 일치하는 cell-free DNA가 검출되는지의 여부를 NGS로 확인한 사례가 발표되었다. 이 뿐만 아니라 임산부의 혈액에서 태아의 cell-free DNA가 발견된 연구를 이용하여 태아의 비침투 산전 검사를 수행한 연구가 발표되었다. 질병을 일으키는 대장균 등 다양한 세균들과 자궁경부암을 일으키는 HPV 등 바이러스의 체내 존재 여부 및 종 식별을 NGS로 빠르게 분석할 수 있게 되었다.

(4) Mapping-by-sequencing 법을 이용한 Forward genetic screening
 전통적인 forward genetic screening은 표준 개체와 돌연변이를 지속적으로 교배하면서 유전자 마커를 기준으로 mapping해야 했으므로 오랜 시간이 소요되었다. 그러나 NGS 분석 비용이 감소한 현재는 NGS를 이용하여 돌연변이체의 유전체를 분석하고 표준 유전체와 직접 비교함으로써 분석 시간을 단축할 수 있게 되었다.

(5) GWAS (Genome-Wide Association Study)
 GWAS란 각 개체의 유전체를 해독하여 비교, 분석함으로써 특정 질병과 연관된 유전적 요인을 찾고자 하는 연구이다. 인간의 SNP는 1억 개 가량이 발견되었고, 이 정보를 바탕으로 특정 질환을 앓고 있는 환자와 정상인의 유전체를 해독함으로서 SNP의 차이를 분석해 환자 집단에서의 해당하는 유전자를 추려내어 질환과 연관된 유전자를 발굴해내는 것이 GWAS의 연구 방법이다.

(6) 미생물의 종 식별 및 메타지노믹스(metagenomics)
 동, 식물에 비해 미생물의 유전체는 상대적으로 크기가 작기 때문에 유전체 해독이 상당히 진행되었다. 현재 미생물학계에서는 단일 생물종의 유전체 해독 연구를 넘어서서, 특정 환경에서 수집한 샘플에 함유된 유전체를 분석함으로써 각 환경의 미생물 군집을 파악하고자 하는 meta-genomics 연구가 활발히 수행되고 있다.

(7) Single-cell genomics
 NGS 분석 기술이 발달함에 따라 미량의 DNA 시료로도 성공적으로 sequencing 분석이 가능해지면서 단일 세포의 유전체를 알고자하는 single-cell genomics 연구가 활기를 띄게 되었다. 세포 분열과정에서 DNA가 복제를 거듭하면서 돌연변이가 발생할 가능성이 항상 존재한다. 따라서 한 개체에 있는 세포라 하더라도 각각의 유전체에는 미묘한 변이가 발생한다. 또한 이러한 돌연변이는 질환의 원인으로 작용하기도 하는데 한 연구에 따르면 정상 조직과 질환을 앓고 있는 조직의 유전체를 비교했을 때 변이율이 이론상 계산 결과보다 상당히 높았다. Single cell genomics를 통해 각 단일 세포의 유전체 서열을 분석함으로써 발달 생물학이나 암 생물학 연구에 응용시킬 수 있다. Single-cell genomics 연구에서는 아직까지 단일 세포의 정확한 분리와 미량 유전체의 증폭이 정확하지 않다는 한계점을 갖고 있어 현재의 NGS 분석을 위해서는 유전체 증폭 등의 과정이 필수적이다.

(8) de novo assembly(신생조합)
 de novo assembly는 아직 전체 염기서열이 해독되지 않은 생명체의 염기서열을 NGS로 분석하여 genome 또는 transcriptome을 구축하는 작업을 말한다. NGS 기술의 발전과 이를 뒷받침하는 생물 정보학의 발달로 주요 모델 생물에 이어 다양한 생물자원의 유전체 해독이 가능하게 되었다. 이러한 연구는 수많은 동물들의 유전체 해독을 목표로 현재는 1만종 이상의 척추동물 유전체를 해독하자는 Genome 10K 프로젝트가 추진되고 있다. NGS를 이용한 de novo assembly가 본격적으로 시작되기 전 이미 BAC 클론을 이용한 생어 시퀀싱으로 해독되고 있던 유전체들도 이제까지 얻은 결과와 NGS를 이용한 분석 결과를 조합함으로써 유전체 해독에 가속도를 붙일 수 있었다. 하지만 아직까지 NGS만으로 해독된 유전체 정보는 생어 시퀀싱으로 제작된 유전체에 비해 전체적인 완성도가 낮다는 한계를 갖고 있어 NGS만을 이용하여 de novo assembly를 진행하고 있지는 않다.

(9) Transcriptome sequencing
 mRNA sequencing은 NGS 기술의 발달로 현재 대부분 RNA-Seq으로 대체되었다. 기존 Microarray 방법으로는 특정 mRNA의 증가 또는 감소량 정도만 파악할 수 있었지만, NGS는 mRNA의 염기 서열을 직접 해독하게 됨으로써 그 전까지 불가능했던 RNA editing이나 대립유전자의 특정적인 발현(allele-specific expression) 등의 관찰이 가능하게 되었다. 게다가 mRNA 뿐만 아니라 small RNA 등의 non-coding RNA의 분석도 가능하게 되었으며, 엑손/인트론 구별 및 서열 정보가 불충분한 생물의 trasncript들까지도 분석 가능한 수단으로 사용된다.
 ☞ 여기서 잠깐, RNA-Seq은 mRNA나 miRNA 등 원하는 RNA를 분리한 뒤, RNA를 DNA로 변환한 후 어답터를 붙여 라이브러리를 제작하는 것이다. RNA는 유전체와 달리 세포 내에 존재하는 양이 그 특징에 따라 매우 다양하기 때문에, 극소량의 mRNA까지 성공적으로 검출해내기 위해서는 최대한 많은 read를 읽음으로써 sequencing depth를 올리는 것이 무엇보다도 중요하다. 또한 transcriptome의 대다수를 차지하는 rRNA 등을 효과적으로 제거하는 것도 도움이 된다. 하지만 아직까지 miRNA 등 small RNA는 크기가 작기 때문에, 라이브러리 제작에 사용되는 아답터의 false positive 아답터-이합체(adapter-dimer) 와 구별하기 어렵다는 한계점이 있어 NGS를 이용한 transcriptome 분석법의 발전을 위해서는 고품질의 라이브러리 제작법에 대한 연구가 뒷받침되어야 할 것이다.

 산업계에서의 NGS 응용 가능성은 최근 다양한 측면으로 제시되고 있다.  특정 세포주를 세대를 반복하여 ‘계대 배양’(세포 증식을 위해 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법)하면 그 과정에서 유전체 또는 후성 유전학적 변이가 생기는 경우가 있는데, 각 세포주의 유전체를 NGS를 이용하여 빠르게 분석하며 각 단계에서의 돌연변이를 모니터링 함으로써 세포주의 품질을 유지할 수 있게 되었다. 또한 다양한 환경에서의 세포의 활성 변화 및 유전자 발현 패턴의 변화를 관찰하는 데에도 유용하게 사용되고 있어 각 유전자의 기능을 연구하던 연구자들은 이제 특정 생명 현상과 관련된 모든 유전자들 사이의 상관관계를 통합적으로 파악할 수 있게 되었다. NGS 분석에 소요되는 비용이 저렴해진 만큼, 향후 생어 시퀀싱 방법의 사용과 같이 빈번하게 사용될 것이다. 다만 한 번의 NGS 분석으로 상당히 많은 양의 데이터가 생성되기 때문에, 생성된 데이터를 어떻게 분석하여 그 중에서 유의미한 결과를 추출해낼 것인지에 대한 충분한 계획을 세워야 한다.  빠르게 변하는 기술 동향을 정확하게 파악하면서 NGS 기술을 아는 만큼 응용할 수 있었으면 한다.

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  1. 표절봇 2018.01.15 15:30 신고  댓글주소  수정/삭제  댓글쓰기

    BRIC View 동향리포트인
    '최근 차세대염기서열분석(NGS) 기술 발전과 향후 연구방향'을
    그대로 베껴서 작성하셨는데
    출처표기 하나 없이 이렇게 해도 되는 건가요?

분자진단의 어벤져스! 4가지 기술을 소개합니다!

 

 세포 내에서 일어나는 다양한 분자 수준의 변화를 평가할 수 있는 분자진단 기법에는 수많은 기술들이 있다. 이번 기사에서는 분자진단시장을 지배하고 있는 대표적 기술 네 가지를 소개해 보고자 한다. 네 가지 기술은 마이크로 어레이(microarray), ②형광 동소 교잡법(fluorescent in situ hybridization), ③중합효소 연쇄 반응(PCR, Polymerase Chain Reaction), ④차세대 염기 서열 분석(NGS, Next-Generation Sequencing)이다.

출처 : https://www.quora.com/What-is-the-central-dogma-of-molecular-biology-Is-it-true

 우선 이 기술들에 대해 설명하기 전에 DNA와 RNA 그리고 단백질이 어떤 과정을 거쳐 세포 내에서 생성되는지 간단한 이론 한 가지를 소개하고자 한다.  ‘Central Dogma' 이론은 왼쪽 그림과 같이 DNA가 RNA로 혹은 기능을 갖고 있는 생산물인 단백질로 바뀌는 분자생물학적 과정과 유전 정보의 흐름을 잘 설명해 주는데, 이 이론에 따르면 DNA가 갖고 있는 유전정보는 전사(transcription) 과정을 통해 RNA로 바뀐다. 이때 DNA의 유전정보가 단백질로 만들어지는 과정에서 조금의 손상이라도 일어나게 된다면 그 DNA는 재사용할 수 없기 때문에 중간에서 이 일을 잘 처리해줄 매개체가 필요하다. 이 매개체가 바로 RNA이다. RNA는 크기가 매우 작은 메신저로 세포 소기관인 리보솜이라 불리는 단백질 합성 공장에 들어가 DNA의 유전정보를 잘 해석하여(translation) 단백질을 만들어 낸다.

 

 첫 번째로 설명할 분자진단 기술은 “Microarray”이다. 이 기술은 대량으로 전사된 전사체의 발현 상황을 총체적으로 빠르게 분석할 수 있는 방법이다. 샘플을 준비해서 RNA를 추출하고 이 RNA에 역전사* 효소를 사용하여 cDNA**를 합성한다.
*전사가 DNA에서 RNA로 진행되어진 거라면 역전사는 유전정보가 RNA에서 DNA로 가는 것을 의미한다.
**cDNA : complementary DNA의 약자로, Reverse transcription(역전사)을 통해 mRNA로부터 합성되어진 분자
 DNA가 RNA보다 일반적으로 안정하므로 혼성화(hybridization)를 위한 단일 가닥(single strand)의 핵산을 RNA로부터 역전사 된 cDNA로 준비하여 마이크로 칩의 상보적인 염기서열과 혼성화시키는 원리를 기본으로 한다. Microarray slide 한 장에 고정시킬 수 있는 cDNA의 수가 수백 개에서 많게는 수 만개이므로 이 기술을 통해 수 만개 유전자의 발현 양상을 동시에 살펴볼 수 있다. cDNA가 합성되면 각각 다른 형광 염색(dye)을 통해 control과 sample을 표지하고 cDNA는 이중 나선 이기 때문에 이중 가닥을 단일 가닥으로 만들어주는 과정을 거쳐 칩에 있는 probe와 혼성화를 시켜주어 형광을 감지한다. Microarray 방법을 통해 샘플에서 추출해 낸 mRNA 수치가 항상 단백질의 양을 대변하는 것이 아니고, 정밀도가 떨어지기 때문에 반정량적인 기술이라는 한계점을 갖고 있다. 게다가 chip위에 존재하는 probe(탐칩)하고만 결합하기 때문에 chip 내에 일치하는 서열이 없다면 전사체의 전체적인 것을 알 수 없게 된다. 또한, hybridization*** 과정에서 교차혼성화(cross- hybridization)로 인한 noise가 발생할 수 있어 정확한 진단방법으로는 사용할 수 없다.
***형광물질을 염색체에 부착시키는 검사과정을 교잡반응(hybridization)이라 부른다.

출처 : http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/cdna-and-microarrays.html

 두 번째, 형광동소교잡법(fluorescent in situ hybridization)기술은 형광동소교합법, ‘FISH’로도 많이 불린다. 이 방법은 특정 DNA 염기서열의 존재유무를 규명하기 위하여 세포배양이나 DNA의 추출과정을 거치지 않고 염색체나 핵의 형태를 그대로 유지한 채 진행된다. 세포를 슬라이드에 도말하고 관찰하고자 하는 표적유전자의 특정 염기서열과 상보적인 DNA에 형광물질을 붙인 후 여러 종류의 탐침자(probe)****와 반응시켜 해당 표적유전자가 존재하는지, 존재한다면 그 위치를 확인함으로써 염색체나 유전자의 변이를 형광현미경으로 관찰하는 방법이다.
****무엇인가 원하는 것을 찾아내는 역할을 하는 매개체
실험 순서는 다음과 같다.

출처 : http://blog.daum.net/bioand/848

우선, 염색체 표본을 Slide Glass에 올려놓고 준비한 Probe DNA를 표본이 있는 Slide Glass에 실험에 필요한 시약들과 함께 첨가한다. 이중가닥 (Double Strand) DNA를 변성(Denaturation) 과정을 통해 단일가닥 DNA로 풀어줌으로서 교잡반응 과정을 준비한다. 교잡반응을 통해 단일가닥으로 변한 Probe DNA가 Sample DNA와 결합하게 되고 세정 과정을 통해 결합하지 않은 잔여 DNA를 제거한 뒤 형광을 확인한다. 따라서 종양임을 증명, 질환 분류, 종양의 재발 추적, 암유전자 위치연구, 기저 유전질환의 확인 등으로 응용할 수 있다. 대표적인 예로 혈액 종양 형광동소교잡법 검사는 혈액종양에서 수 백 개 이상의 세포 중 유전자 재배열을 가진 악성세포를 정확하게 정량 분석함으로서 추적 및 예후 판정에 도움을 준다. 형광동소교잡법이 정량적 분석뿐만 아니라 형태학적 관찰과 함께 검사 소요시간 단축, 간기 세포의 분석이 가능하다는 특징을 갖고 있으나, 검사시약이 고가이고, probe에 대한 결과만 알 수 있다는 한계가 있다.

 세 번째, PCR(polymerase chain reaction)은 내열성 DNA 중합효소를 이용하여, 특정 유전자를 분석 혹은 유전자 조작 가능한 수준으로 증폭하는 방법이다. 이 방법은 온도 순환(cycling)을 통하여, 증폭 부위 양 말단에 해당하는 염기서열을 가진 primer***** 쌍이 증폭 대상 DNA에 결합하고, 중합되고, 다시 떨어지는 과정을 반복하면서 특정 부위의 DNA를 기하급수적으로 합성해내는 과정을 말한다.
*****프라이머 : DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열(짧은 가닥의 RNA)로 DNA 복제과정에서 DNA합성에 이용됨

 

출처 :http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=jintaeky&logNo=220270279599

 마지막 차세대 염기서열 분석(NGS, Next-generation sequencing) 기술은 DNA 서열을 조각내어 빠르고 정확하게 읽어내는 방법으로 유전체 해독에 소요되는 비용과 시간을 획기적으로 줄여준다. 기본적으로 DNA 서열을 증폭해 형광 표식 등을 카메라로 찍고 이를 이미지 처리함으로써 염기를 읽어 낸다. 다음과 같이 NGS 샘플 준비 과정이 끝나면 데이터 분석을 하게 되는데 크게 ‘pre-processing’, ‘assembly’, ‘assembly를 이용한 이차 분석’으로 나누어진다. Pre- processing 단계에서는 다양한 플랫폼으로부터 서열화(sequencing)된 정보를 모으는 (assembly) 단계에 적용하기 위한 작업을 수행하고, 분석의 방향과 목적에 맞게 assembly를 수행한다. 이 후 assembly 결과를 이용한 variation 분석, binding site 분석, expression 분석 및 전체 정보에 대한 다양한 이차정보를 분석하게 된다.

출처 : https://www.abmgood.com/Next-Generation-Sequencing-Service.html

 Sanger sequencing을 1세대 Sequencing으로 하여 현재는 4세대까지 발전되었고, NGS는 다양한 응용분석이 가능하므로 염기서열 분석 외에도 유전자 발현분석, epigenetics 분석, metagenome분석 등이 가능해 다양한 연구목적에 효율적으로 적용되고 있다.  분자진단이 유전체 검사를 통해 질병 감염여부를 확인하는 등 조기진단을 통한 예방과 효율적인 치료에 큰 도움이 되는 분야인 만큼 다양한 기술들의 발전이 곧 분자진단시장의 새로운 시대를 열 것이라 생각한다.

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